304 roestvrijstalen spiraalbuis chemische component. De structuur van het SPACA6-ectodomein bevat een geconserveerde superfamilie van eiwitten die geassocieerd zijn met gametenfusie.

Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden wij u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Sliders met drie artikelen per dia.Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door de dia's te bladeren, of de knoppen op de schuifregelaar aan het einde om door elke dia te bladeren.

SPACA6 is een in sperma tot expressie gebracht oppervlakte-eiwit dat cruciaal is voor gametenfusie tijdens de seksuele voortplanting van zoogdieren.Ondanks deze fundamentele rol wordt de specifieke functie van SPACA6 slecht begrepen.We verduidelijken de kristalstructuur van het extracellulaire domein van SPACA6 met een resolutie van 2,2 Å, waardoor een eiwit met twee domeinen wordt onthuld dat bestaat uit een vierstrengige bundel en Ig-achtige β-sandwiches verbonden door quasi-flexibele linkers.Deze structuur lijkt op IZUMO1, een ander gameetfusie-geassocieerd eiwit, waardoor SPACA6 en IZUMO1 stichtende leden zijn van de superfamilie van bevruchting-geassocieerde eiwitten waarnaar hierin wordt verwezen als de IST-superfamilie.De IST-superfamilie wordt structureel gedefinieerd door zijn gedraaide bundel met vier helixen en een paar disulfide-gekoppelde CXXC-motieven.Een op structuur gebaseerde AlphaFold-zoekopdracht van het menselijke proteoom identificeerde extra eiwitleden van deze superfamilie;met name zijn veel van deze eiwitten betrokken bij gametenfusie.De SPACA6-structuur en de relatie ervan met andere leden van de IST-superfamilie vormen de ontbrekende schakel in onze kennis van gametenfusie bij zoogdieren.
Elk menselijk leven begint met twee afzonderlijke haploïde gameten: het sperma van de vader en het ei van de moeder.Dit sperma is de winnaar van een intens selectieproces waarbij miljoenen spermacellen de vrouwelijke geslachtsorganen passeren, verschillende obstakels overwinnen1 en capacitatie ondergaan, wat hun beweeglijkheid en het proces van oppervlaktecomponenten verbetert2,3,4.Zelfs als het sperma en de eicel elkaar vinden, is het proces nog niet voorbij.De eicel is omgeven door een laag cumuluscellen en een glycoproteïnebarrière, de zona pellucida genaamd, waar sperma doorheen moet om de eicel binnen te komen.Spermatozoa gebruiken een combinatie van oppervlakteadhesiemoleculen en membraangeassocieerde en uitgescheiden enzymen om deze laatste barrières te overwinnen5.Deze moleculen en enzymen worden voornamelijk opgeslagen in het binnenmembraan en de acrosomale matrix en worden gedetecteerd wanneer het buitenmembraan van het sperma wordt gelyseerd tijdens de acrosomale reactie6.De laatste stap in deze intense reis is de sperma-eicelfusie, waarbij de twee cellen hun membranen samensmelten om één enkel diploïde organisme te worden7.Hoewel dit proces baanbrekend is in de menselijke voortplanting, worden de noodzakelijke moleculaire interacties slecht begrepen.
Naast de bevruchting van gameten is de chemie van de fusie van twee lipidedubbellagen uitgebreid bestudeerd.Over het algemeen is membraanfusie een energetisch ongunstig proces waarbij een eiwitkatalysator een structurele conformatieverandering moet ondergaan die twee membranen dichter bij elkaar brengt, waardoor hun continuïteit wordt verbroken en fusie wordt veroorzaakt8,9.Deze eiwitkatalysatoren staan ​​bekend als fusogenen en zijn in talloze fusiesystemen aangetroffen.Ze zijn nodig voor virale toegang tot gastheercellen (bijv. gp160 in HIV-1, piek in coronavirussen, hemagglutinine in influenzavirussen)10,11,12 placenta (syncytine)13,14,15 en gameetvormende fusies in lagere eukaryoten ( HAP2/GCS1 in planten, protisten en geleedpotigen) 16,17,18,19.Fusogenen voor menselijke gameten moeten nog worden ontdekt, hoewel is aangetoond dat verschillende eiwitten cruciaal zijn voor de hechting en fusie van gameten.Het in de eicel tot expressie gebrachte CD9, een transmembraaneiwit dat nodig is voor de fusie van gameten van muizen en mensen, was de eerste die werd ontdekt 21,22,23.Hoewel de precieze functie ervan onduidelijk blijft, lijkt een rol bij adhesie, de structuur van adhesiefoci op microvilli van eieren en/of de correcte lokalisatie van eiceloppervlakte-eiwitten waarschijnlijk 24,25,26.De twee meest typische eiwitten die cruciaal zijn voor gametenfusie zijn het sperma-eiwit IZUMO127 en het eiceleiwit JUNO28, en hun onderlinge associatie is een belangrijke stap in de herkenning en adhesie van gameten voorafgaand aan fusie.Mannelijke Izumo1 knock-out muizen en vrouwelijke Juno knock-out muizen zijn volledig steriel; in deze modellen komt sperma de perivitellineruimte binnen, maar gameten fuseren niet.Op dezelfde manier werd de confluentie verminderd wanneer gameten werden behandeld met anti-IZUMO1- of JUNO27,29-antilichamen in menselijke in-vitrofertilisatie-experimenten.
Onlangs is een nieuw ontdekte groep van in sperma tot expressie gebrachte eiwitten ontdekt die fenotypisch vergelijkbaar zijn met IZUMO1 en JUNO20,30,31,32,33,34,35.Sperma-acrosoommembraan-geassocieerd eiwit 6 (SPACA6) is geïdentificeerd als essentieel voor bevruchting in een grootschalig mutageneseonderzoek bij muizen.Insertie van het transgen in het Spaca6-gen produceert niet-smeltbare spermatozoa, hoewel deze spermatozoa de perivitellineruimte infiltreren 36 .Daaropvolgende knock-outstudies bij muizen bevestigden dat Spaca6 nodig is voor gametenfusie 30,32.SPACA6 komt vrijwel uitsluitend tot expressie in de testikels en heeft een lokalisatiepatroon dat vergelijkbaar is met dat van IZUMO1, namelijk binnen de intima van de spermatozoa vóór de acrosomale reactie, en migreert vervolgens naar het equatoriale gebied na de acrosomale reactie 30,32.Spaca6-homologen komen voor in een verscheidenheid aan zoogdieren en andere eukaryoten 30 en het belang ervan voor de fusie van menselijke gameten is aangetoond door remming van menselijke bevruchting in vitro door resistentie tegen SPACA6 30 .In tegenstelling tot IZUMO1 en JUNO blijven de details van de structuur, interacties en functie van SPACA6 onduidelijk.
Om het fundamentele proces dat ten grondslag ligt aan de fusie van menselijk sperma en eieren beter te begrijpen, waardoor we toekomstige ontwikkelingen op het gebied van gezinsplanning en vruchtbaarheidsbehandelingen kunnen informeren, hebben we structurele en biochemische SPACA6-onderzoeken uitgevoerd.De kristalstructuur van het extracellulaire domein van SPACA6 toont een bundel met vier helixen (4HB) en een immunoglobuline-achtig (Ig-achtig) domein verbonden door quasi-flexibele gebieden.Zoals voorspeld in eerdere studies is de domeinstructuur van SPACA6 vergelijkbaar met die van menselijk IZUMO1, en delen de twee eiwitten een ongebruikelijk motief: 4HB met een driehoekig spiraalvormig oppervlak en een paar disulfide-gekoppelde CXXC-motieven.We stellen voor dat IZUMO1 en SPACA6 nu een grotere, structureel verwante superfamilie van eiwitten definiëren die geassocieerd zijn met gametenfusie.Met behulp van kenmerken die uniek zijn voor de superfamilie, hebben we een uitgebreide zoektocht uitgevoerd naar het structurele menselijke proteoom van AlphaFold, waarbij we aanvullende leden van deze superfamilie hebben geïdentificeerd, waaronder verschillende leden die betrokken zijn bij gametenfusie en/of bevruchting.Het lijkt er nu op dat er een gemeenschappelijke structurele vouw en superfamilie van eiwitten bestaat die geassocieerd zijn met gametenfusie, en onze structuur biedt een moleculaire kaart van dit belangrijke aspect van het menselijke gametenfusiemechanisme.
SPACA6 is een transmembraaneiwit met één doorgang met één N-gekoppelde glycaan en zes vermeende disulfidebindingen (figuren S1a en S2).We brachten het extracellulaire domein van menselijk SPACA6 (residuen 27-246) tot expressie in Drosophila S2-cellen en zuiverden het eiwit met behulp van nikkelaffiniteit, kationenuitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie (Fig. S1b).Het gezuiverde SPACA6-ectodomein is zeer stabiel en homogeen.Analyse met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie gecombineerd met polygonale lichtverstrooiing (SEC-MALS) onthulde één piek met een berekend molecuulgewicht van 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Dit komt overeen met de grootte van het SPACA6 monomere ectodomein, wat aangeeft dat oligomerisatie niet plaatsvond tijdens zuivering.Bovendien onthulde circulair dichroïsme (CD) spectroscopie een gemengde α/β-structuur met een smeltpunt van 51,3 ° C (Fig. S1d, e).Deconvolutie van de CD-spectra onthulde 38,6% α-helix en 15,8% β-stranded elementen (Figuur S1d).
Het SPACA6-ectodomein werd gekristalliseerd met behulp van willekeurige matrixzaaien, resulterend in een dataset met een resolutie van 2, 2 Å (Tabel 1 en Figuur S3).Met behulp van een combinatie van op fragmenten gebaseerde moleculaire substitutie en SAD-faseringsgegevens met blootstelling aan bromide voor structuurbepaling (Tabel 1 en Figuur S4), bestaat het uiteindelijke verfijnde model uit residuen 27-246.Op het moment dat de structuur werd bepaald, waren er geen experimentele of AlphaFold-structuren beschikbaar.Het SPACA6-ectodomein meet 20 Å x 20 Å x 85 Å, bestaat uit zeven helices en negen β-strengen, en heeft een langwerpige tertiaire vouw gestabiliseerd door zes disulfidebindingen (Fig. La, b).De zwakke elektronendichtheid aan het einde van de Asn243-zijketen geeft aan dat dit residu een N-gekoppelde glycosylatie is.De structuur bestaat uit twee domeinen: een N-terminale bundel met vier helixen (4HB) en een C-terminaal Ig-achtig domein met een tussenliggend scharniergebied ertussen (figuur 1c).
een structuur van het extracellulaire domein van SPACA6.Strookdiagram van het extracellulaire domein van SPACA6, de kleur van de keten van N tot C-terminus van donkerblauw tot donkerrood.Cysteïnes die betrokken zijn bij disulfidebindingen zijn gemarkeerd in magenta.b Topologie van het extracellulaire domein van SPACA6.Gebruik hetzelfde kleurenschema als in figuur 1a.c SPACA6 extracellulair domein.De 4HB-, scharnier- en Ig-achtige domeinstrookdiagrammen zijn respectievelijk oranje, groen en blauw gekleurd.De lagen zijn niet op schaal getekend.
Het 4HB-domein van SPACA6 omvat vier hoofdhelices (helices 1-4), die zijn gerangschikt in de vorm van een spiraalvormige helix (Fig. 2a), afwisselend tussen antiparallelle en parallelle interacties (Fig. 2b).Een kleine extra spiraal met enkele winding (helix 1′) wordt loodrecht op de bundel gelegd en vormt een driehoek met de spiralen 1 en 2. Deze driehoek is enigszins vervormd in de spiraalvormig gedraaide pakking van de relatief dichte pakking van de spiralen 3 en 4 ( Afb. 2a).
4HB N-klemmenstrookschema.b Bovenaanzicht van een bundel van vier helices, waarbij elke helix donkerblauw is gemarkeerd aan het N-uiteinde en donkerrood aan het C-uiteinde.c Top-down spiraalwieldiagram voor 4HB, waarbij elk residu wordt weergegeven als een cirkel, gelabeld met een aminozuurcode van één letter;alleen de vier aminozuren bovenaan het wiel zijn genummerd.Niet-polaire residuen zijn geel gekleurd, polaire ongeladen residuen zijn groen gekleurd, positief geladen residuen zijn blauw gekleurd en negatief geladen residuen zijn rood gekleurd.d Driehoekige vlakken van het 4HB-domein, met 4HB's in oranje en scharnieren in groen.Beide inzetstukken vertonen staafvormige disulfidebindingen.
4HB is geconcentreerd op een binnenste hydrofobe kern die voornamelijk bestaat uit alifatische en aromatische residuen (Fig. 2c).De kern bevat een disulfidebinding tussen Cys41 en Cys55 die helices 1 en 2 met elkaar verbindt in een bovenste verhoogde driehoek (Fig. 2d).Er werden twee extra disulfidebindingen gevormd tussen het CXXC-motief in Helix 1 'en een ander CXXC-motief gevonden aan de punt van de β-haarspeld in het scharniergebied (figuur 2d).Een conservatief arginineresidu met een onbekende functie (Arg37) bevindt zich in een holle driehoek gevormd door helices 1′, 1 en 2. Alifatische koolstofatomen Cβ, Cγ en Cδ Arg37 interageren met de hydrofobe kern, en de guanidinegroepen bewegen cyclisch. tussen helices 1 'en 1 via interacties tussen de Thr32-skelet en zijketen (Fig. S5a, b).Tyr34 strekt zich uit tot in de holte en laat twee kleine holtes achter waardoor Arg37 kan interageren met het oplosmiddel.
Ig-achtige β-sandwichdomeinen vormen een grote superfamilie van eiwitten die het gemeenschappelijke kenmerk delen van twee of meer meerstrengige amfipathische β-sheets die interageren via een hydrofobe kern 39. Het C-terminale Ig-achtige domein van SPACA6 heeft hetzelfde patroon en bestaat uit twee lagen (Fig. S6a).Blad 1 is een β-blad van vier strengen (strengen D, F, H en I) waarbij de strengen F, H en I een anti-parallelle opstelling vormen, en de strengen I en D een parallelle interactie aangaan.Tabel 2 is een kleine anti-parallelle dubbelstrengige bètaplaat (strengen E en G).Een interne disulfidebinding werd waargenomen tussen het C-uiteinde van de E-keten en het midden van de H-keten (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Deze disulfidebinding is analoog aan de disulfidebinding in het β-sandwichdomein van immunoglobuline40,41.
De vierstrengige β-plaat kronkelt over de gehele lengte en vormt asymmetrische randen die qua vorm en elektrostatica verschillen.De dunnere rand is een vlak hydrofoob omgevingsoppervlak dat opvalt in vergelijking met de resterende ongelijke en elektrostatisch diverse oppervlakken in SPACA6 (Fig. S6b, c).Een halo van blootgestelde carbonyl- / aminogroepen in de hoofdketen en polaire zijketens omringt het hydrofobe oppervlak (Fig. S6c).De bredere marge wordt bedekt door een afgedekt spiraalvormig segment dat het N-terminale gedeelte van de hydrofobe kern blokkeert en drie waterstofbruggen vormt met de open polaire groep van de F-ketenskelet (Fig. S6d).Het C-terminale gedeelte van deze rand vormt een grote zak met een gedeeltelijk blootliggende hydrofobe kern.De pocket is omgeven door positieve ladingen als gevolg van drie sets dubbele arginineresiduen (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 en Arg212-Arg214) en een centraal histidine (His220) (Figuur S6e).
Het scharniergebied is een kort segment tussen het spiraalvormige domein en het Ig-achtige domein, bestaande uit één antiparallelle driestrengige β-laag (strengen A, B en C), een kleine 310-helix en verschillende lange willekeurige spiraalvormige segmenten.(Afb. S7).Een netwerk van covalente en elektrostatische contacten in het scharniergebied lijkt de oriëntatie tussen 4HB en het Ig-achtige domein te stabiliseren.Het netwerk kan in drie delen worden verdeeld.Het eerste deel omvat twee CXXC-motieven (27CXXC30 en 139CXXC142) die een paar disulfidebindingen vormen tussen de β-haarspeld in het scharnier en de 1'-helix in 4HB.Het tweede deel omvat elektrostatische interacties tussen het Ig-achtige domein en het scharnier.Glu132 in het scharnier vormt een zoutbrug met Arg233 in het Ig-achtige domein en Arg135 in het scharnier.Het derde deel omvat een covalente binding tussen het Ig-achtige domein en het scharniergebied.Twee disulfidebindingen (Cys124-Cys147 en Cys128-Cys153) verbinden de scharnierlus met een linker die wordt gestabiliseerd door elektrostatische interacties tussen Gln131 en de functionele ruggengraatgroep, waardoor toegang tot het eerste Ig-achtige domein mogelijk wordt.ketting.
De structuur van het SPACA6-ectodomein en individuele structuren van 4HB- en Ig-achtige domeinen werden gebruikt om te zoeken naar structureel vergelijkbare records in eiwitdatabases 42 .We identificeerden matches met hoge Dali Z-scores, kleine standaarddeviaties en grote LALI-scores (de laatste is het aantal structureel gelijkwaardige residuen).Terwijl de eerste 10 treffers van de volledige ectodomein-zoekopdracht (tabel S1) een acceptabele Z-score van> 842 hadden, toonde een zoekopdracht naar alleen 4HB- of Ig-achtig domein aan dat de meeste van deze treffers alleen met β-sandwiches correspondeerden.een alomtegenwoordige vouw die in veel eiwitten voorkomt.Alle drie de zoekopdrachten in Dali leverden slechts één resultaat op: IZUMO1.
Er wordt al lang gesuggereerd dat SPACA6 en IZUMO1 structurele overeenkomsten delen7,32,37.Hoewel de ectodomeinen van deze twee gameetfusie-geassocieerde eiwitten slechts 21% sequentie-identiteit delen (Figuur S8a), maakte complex bewijsmateriaal, waaronder een geconserveerd disulfidebindingspatroon en een voorspeld C-terminaal Ig-achtig domein in SPACA6, vroege pogingen mogelijk om een homologiemodel van een SPACA6-muis met behulp van IZUMO1 als sjabloon .Onze structuur bevestigt deze voorspellingen en toont de ware mate van gelijkenis.In feite delen de SPACA6- en IZUMO137,43,44-structuren dezelfde architectuur met twee domeinen (Fig. S8b) met vergelijkbare 4HB- en Ig-achtige β-sandwichdomeinen verbonden door een scharniergebied (Fig. S8c).
IZUMO1 en SPACA6 4HB hebben gemeenschappelijke verschillen met conventionele spiraalbundels.Typische 4HB's, zoals die gevonden worden in SNARE-eiwitcomplexen die betrokken zijn bij endosomale fusie 45,46, hebben gelijkmatig verdeelde helices die een constante kromming rond een centrale as behouden 47. Daarentegen waren de helixdomeinen in zowel IZUMO1 als SPACA6 vervormd, met variabele kromming en ongelijkmatige pakking (Figuur S8d).De draaiing, waarschijnlijk veroorzaakt door de driehoek gevormd door helices 1', 1 en 2, blijft behouden in IZUMO1 en SPACA6 en gestabiliseerd door hetzelfde CXXC-motief op helix 1'.De extra disulfidebinding die wordt aangetroffen in SPACA6 (Cys41 en Cys55 die helices 1 en 2 hierboven covalent met elkaar verbinden) creëert echter een scherpere top bij de driehoektop, waardoor SPACA6 meer gedraaid is dan IZUMO1, met meer uitgesproken holtedriehoeken.Bovendien mist IZUMO1 Arg37 waargenomen in het midden van deze holte in SPACA6.IZUMO1 heeft daarentegen een meer typische hydrofobe kern van alifatische en aromatische residuen.
IZUMO1 heeft een Ig-achtig domein dat bestaat uit een dubbelstrengige en vijfstrengige β-sheet43.De extra streng in IZUMO1 vervangt de spoel in SPACA6, die samenwerkt met de F-streng om de waterstofbruggen in de kern te beperken.Een interessant vergelijkingspunt is de voorspelde oppervlaktelading van de Ig-achtige domeinen van de twee eiwitten.Het IZUMO1-oppervlak is negatiever geladen dan het SPACA6-oppervlak.Een extra lading bevindt zich nabij het C-uiteinde tegenover het spermamembraan.In SPACA6 waren dezelfde regio's neutraler of positief geladen (Fig. S8e).Het hydrofobe oppervlak (dunnere randen) en positief geladen putten (bredere randen) in SPACA6 zijn bijvoorbeeld negatief geladen in IZUMO1.
Hoewel de relatie en secundaire structuurelementen tussen IZUMO1 en SPACA6 goed bewaard zijn gebleven, toonde de structurele uitlijning van de Ig-achtige domeinen aan dat de twee domeinen verschillen in hun algemene oriëntatie ten opzichte van elkaar (Fig. S9).De spiraalbundel van IZUMO1 is gebogen rond de β-sandwich, waardoor de eerder beschreven “boemerang”-vorm ontstaat op ongeveer 50° vanaf de centrale as.Daarentegen was de spiraalvormige straal in SPACA6 ongeveer 10° in de tegenovergestelde richting gekanteld.De verschillen in deze oriëntaties zijn waarschijnlijk te wijten aan verschillen in het scharniergebied.Op het niveau van de primaire sequentie delen IZUMO1 en SPACA6 weinig sequentie-overeenkomst bij het scharnier, met uitzondering van cysteïne-, glycine- en asparaginezuurresiduen.Als gevolg hiervan zijn waterstofbruggen en elektrostatische netwerken totaal verschillend.Secundaire structuurelementen van β-sheets worden gedeeld door IZUMO1 en SPACA6, hoewel de ketens in IZUMO1 veel langer zijn en de 310-helix (helix 5) uniek is voor SPACA6.Deze verschillen resulteren in verschillende domeinoriëntaties voor twee overigens vergelijkbare eiwitten.
Uit onze Dali-serverzoekopdracht bleek dat SPACA6 en IZUMO1 de enige twee experimenteel bepaalde structuren zijn die zijn opgeslagen in de eiwitdatabase en die deze specifieke 4HB-vouw hebben (Tabel S1).Meer recentelijk heeft DeepMind (Alphabet/Google) AlphaFold ontwikkeld, een op een neuraal netwerk gebaseerd systeem dat de 3D-structuren van eiwitten nauwkeurig kan voorspellen op basis van primaire sequenties48.Kort nadat we de SPACA6-structuur hadden opgelost, werd de AlphaFold-database vrijgegeven, die voorspellende structuurmodellen opleverde die 98,5% van alle eiwitten in het menselijke proteoom bestrijken48,49.Met behulp van onze opgeloste SPACA6-structuur als zoekmodel identificeerde een structurele homologiezoektocht naar het model in het AlphaFold menselijke proteoom kandidaten met mogelijke structurele overeenkomsten met SPACA6 en IZUMO1.Gegeven de ongelooflijke nauwkeurigheid van AlphaFold bij het voorspellen van SPACA6 (Fig. S10a) – vooral het ectodomein van 1,1 Å rms vergeleken met onze opgeloste structuur (Fig. S10b) – kunnen we erop vertrouwen dat de geïdentificeerde SPACA6-matches waarschijnlijk accuraat zijn.
Eerder zocht PSI-BLAST naar het IZUMO1-cluster met drie andere sperma-geassocieerde eiwitten: IZUMO2, IZUMO3 en IZUMO450.AlphaFold voorspelde dat deze IZUMO-familie-eiwitten zich in het 4HB-domein vouwen met hetzelfde disulfidebindingspatroon als IZUMO1 (figuren 3a en S11), hoewel ze een Ig-achtig domein missen.Er wordt verondersteld dat IZUMO2 en IZUMO3 eenzijdige membraaneiwitten zijn die lijken op IZUMO1, terwijl IZUMO4 lijkt te worden uitgescheiden.De functies van IZUMO 2-, 3- en 4-eiwitten bij gametenfusie zijn niet bepaald.Het is bekend dat IZUMO3 een rol speelt bij de biogenese van het acrosoom tijdens de ontwikkeling van sperma51 en het IZUMO-eiwit blijkt een complex te vormen50.Het behoud van IZUMO-eiwitten bij zoogdieren, reptielen en amfibieën suggereert dat hun potentiële functie consistent is met die van andere bekende gametenfusie-geassocieerde eiwitten, zoals DCST1/2, SOF1 en FIMP.
Diagram van de domeinarchitectuur van de IST-superfamilie, met 4HB-, scharnier- en Ig-achtige domeinen respectievelijk gemarkeerd in oranje, groen en blauw.IZUMO4 heeft een uniek C-terminale gebied dat er zwart uitziet.Bevestigde en vermeende disulfidebindingen worden respectievelijk weergegeven door ononderbroken en stippellijnen.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) en TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) worden weergegeven in hetzelfde kleurbereik als paneel A. Disulfidebindingen worden weergegeven in magenta.TMEM95-, IZUMO2- en IZUMO3-transmembraanhelices worden niet getoond.
In tegenstelling tot het IZUMO-eiwit wordt aangenomen dat andere SPACA-eiwitten (dwz SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 en SPACA9) structureel verschillen van SPACA6 (Fig. S12).Alleen SPACA9 heeft 4HB, maar er wordt niet verwacht dat het dezelfde parallelle-anti-parallelle oriëntatie of dezelfde disulfidebinding heeft als SPACA6.Alleen SPACA1 heeft een vergelijkbaar Ig-achtig domein.AlphaFold voorspelt dat SPACA3, SPACA4 en SPACA5 een compleet andere structuur hebben dan SPACA6.Interessant is dat het ook bekend is dat SPACA4 een rol speelt bij de bevruchting, maar in grotere mate dan SPACA6, en in plaats daarvan de interactie tussen sperma en oöcyt zona pellucida vergemakkelijkt.
Onze AlphaFold-zoekopdracht vond een andere match voor IZUMO1 en SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, een enkel spermaspecifiek transmembraaneiwit, maakt mannelijke muizen onvruchtbaar wanneer ze worden weggenomen 32,33.Spermatozoa zonder TMEM95 hadden een normale morfologie, beweeglijkheid en het vermogen om de zona pellucida te penetreren en zich aan het eimembraan te binden, maar konden niet fuseren met het eicelmembraan.Eerdere studies hebben aangetoond dat TMEM95 structurele overeenkomsten vertoont met IZUMO133.Het AlphaFold-model bevestigde inderdaad dat TMEM95 een 4HB is met hetzelfde paar CXXC-motieven als IZUMO1 en SPACA6 en dezelfde extra disulfidebinding tussen helices 1 en 2 gevonden in SPACA6 (Fig. 3a en S11).Hoewel TMEM95 een Ig-achtig domein mist, heeft het een gebied met een disulfidebindingspatroon vergelijkbaar met de SPACA6- en IZUMO1-scharniergebieden (Fig. 3b).Op het moment van publicatie van dit manuscript rapporteerde de preprint-server de structuur van TMEM95, wat het AlphaFold53-resultaat bevestigde.TMEM95 lijkt sterk op SPACA6 en IZUMO1 en is evolutionair al geconserveerd in amfibieën (Fig. 4 en S13).
De PSI-BLAST-zoekopdracht gebruikte de NCBI SPACA6-, IZUMO1-4-, TMEM95-, DCST1-, DCST2-, FIMP- en SOF1-databases om de positie van deze sequenties in de levensboom te bepalen.Afstanden tussen vertakkingspunten zijn niet op schaal weergegeven.
De opvallende algehele structurele gelijkenis tussen SPACA6 en IZUMO1 suggereert dat ze stichtende leden zijn van een geconserveerde structurele superfamilie die de TMEM95- en IZUMO 2-, 3- en 4-eiwitten omvat.bekende leden: IZUMO1, SPACA6 en TMEM95.Omdat slechts een paar leden Ig-achtige domeinen bezitten, is het kenmerk van de IST-superfamilie het 4HB-domein, dat unieke kenmerken heeft die al deze eiwitten gemeen hebben: 1) Opgerold 4HB met helices gerangschikt in een anti-parallelle/parallelle afwisseling (Fig. 5a), 2) de bundel heeft een driehoekig vlak bestaande uit twee helices binnen de bundel en een derde verticale helix (Fig. sleutelgebied (Fig. 5c). Het is bekend dat het CXXC-motief, gevonden in thioredoxine-achtige eiwitten, functioneert als een redoxsensor 54,55,56, terwijl het motief bij leden van de IST-familie kan worden geassocieerd met eiwitdisulfide-isomerasen zoals ERp57 bij gametenfusie.
Leden van de IST-superfamilie worden gedefinieerd door drie karakteristieke kenmerken van het 4HB-domein: vier helices die afwisselen tussen parallelle en antiparallelle oriëntatie, ba-driehoekige spiraalvormige bundelvlakken en een ca CXXC dubbel motief gevormd tussen kleine moleculen.) N-terminale helixen (oranje) en scharniergebied β-haarspeld (groen).
Gezien de gelijkenis tussen SPACA6 en IZUMO1 werd het vermogen van eerstgenoemde om te binden aan IZUMO1 of JUNO getest.Biolaaginterferometrie (BLI) is een op kinetiek gebaseerde bindingsmethode die eerder is gebruikt om de interactie tussen IZUMO1 en JUNO te kwantificeren.Na incubatie van de met biotine gelabelde sensor met IZUMO1 als aas met een hoge concentratie JUNO-analyt, werd een sterk signaal gedetecteerd (Fig. S14a), wat wijst op een door binding geïnduceerde verandering in de dikte van het biomateriaal dat aan de sensortip is bevestigd.Soortgelijke signalen (dwz JUNO gekoppeld aan de sensor als aas tegen IZUMO1-analyt) (Fig. S14b).Er werd geen signaal gedetecteerd toen SPACA6 werd gebruikt als analyt tegen sensorgebonden IZUMO1 of sensorgebonden JUNO (Figuur S14a, b).De afwezigheid van dit signaal geeft aan dat het extracellulaire domein van SPACA6 geen interactie heeft met het extracellulaire domein van IZUMO1 of JUNO.
Omdat de BLI-test gebaseerd is op biotinylatie van vrije lysineresiduen op het aaseiwit, kan deze modificatie binding voorkomen als lysineresiduen bij de interactie betrokken zijn.Bovendien kan de oriëntatie van de binding ten opzichte van de sensor sterische hindernissen veroorzaken, dus werden conventionele pull-down-assays ook uitgevoerd op de recombinante SPACA6-, IZUMO1- en JUNO-ectodomeinen.Desondanks precipiteerde SPACA6 niet met His-gelabeld IZUMO1 of His-gelabeld JUNO (Fig. S14c, d), wat aangeeft dat er geen interactie is die consistent is met die waargenomen in BLI-experimenten.Als positieve controle bevestigden we de interactie van JUNO met het label His IZUMO1 (figuren S14e en S15).
Ondanks de structurele gelijkenis tussen SPACA6 en IZUMO1 is het onvermogen van SPACA6 om JUNO te binden niet verrassend.Het oppervlak van menselijk IZUMO1 heeft meer dan 20 residuen die interageren met JUNO, inclusief residuen uit elk van de drie regio's (hoewel de meeste zich in het scharniergebied bevinden) (Fig. S14f).Van deze residuen is er slechts één geconserveerd in SPACA6 (Glu70).Hoewel veel residusubstituties hun oorspronkelijke biochemische eigenschappen behielden, werd het essentiële Arg160-residu in IZUMO1 vervangen door het negatief geladen Asp148 in SPACA6;eerdere studies hebben aangetoond dat de Arg160Glu-mutatie in IZUMO1 de binding aan JUNO43 vrijwel volledig teniet doet.Bovendien verhoogde het verschil in domeinoriëntatie tussen IZUMO1 en SPACA6 het oppervlak van de JUNO-bindingsplaats van het equivalente gebied op SPACA6 aanzienlijk (Fig. S14g).
Ondanks de bekende behoefte aan SPACA6 voor gametenfusie en de gelijkenis ervan met IZUMO1, lijkt SPACA6 geen gelijkwaardige JUNO-bindende functie te hebben.Daarom hebben we geprobeerd onze structurele gegevens te combineren met bewijs van belang uit de evolutionaire biologie.Sequentie-uitlijning van SPACA6-homologen toont het behoud van de gemeenschappelijke structuur buiten zoogdieren.Cysteïneresiduen zijn bijvoorbeeld zelfs aanwezig in ver verwante amfibieën (Fig. 6a).Met behulp van de ConSurf-server werden retentiegegevens van meerdere sequentie-uitlijningen van 66 sequenties in kaart gebracht op het SPACA6-oppervlak.Dit type analyse kan aantonen welke residuen tijdens de eiwitevolutie zijn geconserveerd en kan aangeven welke oppervlaktegebieden een rol spelen in de functie.
een sequentie-uitlijning van SPACA6-ectodomeinen van 12 verschillende soorten bereid met behulp van CLUSTAL OMEGA.Volgens de ConSurf-analyse zijn de meest conservatieve posities blauw gemarkeerd.Cysteïneresiduen zijn rood gemarkeerd.Domeingrenzen en secundaire structuurelementen worden bovenaan de uitlijning weergegeven, waar pijlen β-strengen aangeven en golven spiralen aangeven.De NCBI Access Identifiers die de sequenties bevatten zijn: mens (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapucijnaap (Cebus mimic, XP_017359366), paard (Equus caballus, XP_023506102), orka (Orcinus orca3_23 XP_032_0 34).), schaap (Ovis aries, XP_014955560), olifant (Loxodonta africana, XP_010585293), hond (Canis lupus familyis, XP_025277208), muis (Mus musculus, NP_001156381), Tasmaanse duivel (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), Vogelbekdier, 8 ) , 61_89 en Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).De nummering is gebaseerd op menselijke volgorde.b Oppervlakteweergave van de SPACA6-structuur met 4HB bovenaan en Ig-achtig domein onderaan, kleuren gebaseerd op instandhoudingsschattingen van de ConSurf-server.De best bewaarde delen zijn blauw, de matig bewaarde delen zijn wit en de minst bewaarde delen zijn geel.paarse cysteïne.In de inzet met de labels 1, 2 en 3 worden drie oppervlaktepatches getoond die een hoog beschermingsniveau demonstreren. In de inzet rechtsboven wordt een 4HB-cartoon weergegeven (zelfde kleurenschema).
De SPACA6-structuur heeft drie sterk geconserveerde oppervlaktegebieden (Fig. 6b).Patch 1 omspant 4HB en het scharniergebied en bevat twee geconserveerde CXXC-disulfidebruggen, een Arg233-Glu132-Arg135-Ser144-scharniernetwerk (Fig. S7) en drie geconserveerde buitenste aromatische residuen (Phe31, Tyr73, Phe137)).een bredere rand van het Ig-achtige domein (Fig. S6e), die verschillende positief geladen residuen op het spermaoppervlak vertegenwoordigt.Interessant is dat deze pleister een antilichaamepitoop bevat waarvan eerder is aangetoond dat het de SPACA6 30-functie verstoort.Gebied 3 overspant het scharnier en één zijde van het Ig-achtige domein;dit gebied bevat geconserveerde prolines (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) en naar buiten gerichte polaire/geladen residuen.Verrassend genoeg zijn de meeste residuen op het oppervlak van 4HB zeer variabel (Fig. 6b), hoewel de vouw behouden blijft in de SPACA6-homoloog (zoals aangegeven door het conservatisme van de hydrofobe bundelkern) en buiten de IST-superfamilie.
Hoewel dit het kleinste gebied in SPACA6 is met de minste detecteerbare secundaire structuurelementen, zijn veel overblijfselen van het scharniergebied (inclusief gebied 3) sterk geconserveerd onder SPACA6-homologen, wat erop kan wijzen dat de oriëntatie van de spiraalbundel en de β-sandwich een rol speelt.als conservatief.Ondanks uitgebreide waterstofbindings- en elektrostatische netwerken in het scharniergebied van SPACA6 en IZUMO1, kan echter bewijs van intrinsieke flexibiliteit worden gezien in de uitlijning van de meerdere toegestane structuren van IZUMO137,43,44.De uitlijning van de individuele domeinen overlapte goed, maar de oriëntatie van de domeinen ten opzichte van elkaar varieerde van 50 ° tot 70 ° ten opzichte van de centrale as (Fig. S16).Om de conformationele dynamiek van SPACA6 in oplossing te begrijpen, werden SAXS-experimenten uitgevoerd (Fig. S17a, b).Ab initio-reconstructie van het SPACA6-ectodomein kwam overeen met een staafkristalstructuur (Fig. S18), hoewel de Kratky-plot enige mate van flexibiliteit vertoonde (Fig. S17b).Deze conformatie staat in contrast met IZUMO1, waarin het ongebonden eiwit zowel in het rooster als in de oplossing een boemerangvorm aanneemt43.
Om het flexibele gebied specifiek te identificeren, werd waterstof-deuteriumuitwisselingsmassaspectroscopie (H-DXMS) uitgevoerd op SPACA6 en vergeleken met eerder verkregen gegevens op IZUMO143 (Fig. 7a, b).SPACA6 is duidelijk flexibeler dan IZUMO1, zoals blijkt uit de hogere deuteriumuitwisseling door de hele structuur na 100.000 s uitwisseling.In beide structuren vertoont het C-terminale deel van het scharniergebied een hoog niveau van uitwisseling, wat waarschijnlijk een beperkte rotatie van 4HB- en Ig-achtige domeinen ten opzichte van elkaar mogelijk maakt.Interessant genoeg is het C-terminale deel van het SPACA6-scharnier, bestaande uit het 147CDLPLDCP154-residu, een sterk geconserveerd gebied 3 (Fig. 6b), wat mogelijk aangeeft dat interdomeinflexibiliteit een evolutionair geconserveerd kenmerk van SPACA6 is.Volgens de flexibiliteitsanalyse toonden de thermische smeltgegevens van CD aan dat SPACA6 (Tm = 51,2 °C) minder stabiel is dan IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (Fig. S1e en S19).
a H-DXMS-afbeeldingen van SPACA6 en b IZUMO1.Het percentage deuteriumuitwisseling werd op de aangegeven tijdstippen bepaald.Niveaus van waterstof-deuteriumuitwisseling worden aangegeven door kleur op een gradiëntschaal van blauw (10%) naar rood (90%).Zwarte dozen vertegenwoordigen gebieden met veel uitwisseling.De grenzen van 4HB, scharnier en Ig-achtig domein waargenomen in de kristalstructuur worden boven de primaire sequentie getoond.Deuteriumuitwisselingsniveaus op 10 s, 1000 s en 100.000 s werden uitgezet op een stripdiagram dat bovenop de transparante moleculaire oppervlakken van SPACA6 en IZUMO1 was gelegd.Delen van constructies met een deuteriumuitwisselingsniveau van minder dan 50% zijn wit gekleurd.Gebieden boven 50% H-DXMS-uitwisseling zijn gekleurd in een gradiëntschaal.
Het gebruik van CRISPR/Cas9 en genetische strategieën voor het uitschakelen van muizengenen heeft geleid tot de identificatie van verschillende factoren die belangrijk zijn voor de binding en fusie van sperma en eieren.Afgezien van de goed gekarakteriseerde interactie van IZUMO1-JUNO en CD9-structuur, blijven de meeste eiwitten geassocieerd met gametenfusie structureel en functioneel raadselachtig.De biofysische en structurele karakterisering van SPACA6 is een ander stukje van de moleculaire adhesie/fusie-puzzel tijdens de bevruchting.
SPACA6 en andere leden van de IST-superfamilie lijken in hoge mate geconserveerd te zijn bij zoogdieren, maar ook bij individuele vogels, reptielen en amfibieën;Er wordt zelfs gedacht dat SPACA6 zelfs nodig is voor de bevruchting bij zebravissen 59. Deze verdeling is vergelijkbaar met die van andere bekende gameetfusie-geassocieerde eiwitten zoals DCST134, DCST234, FIMP31 en SOF132, wat erop wijst dat deze factoren HAP2-deficiënt zijn (ook bekend als GCS1) eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de katalytische activiteit van veel protisten., planten en geleedpotigen.Bevruchte fusie-eiwitten 60, 61. Ondanks de sterke structurele gelijkenis tussen SPACA6 en IZUMO1 resulteerde knock-out van genen die voor een van deze eiwitten codeerden in onvruchtbaarheid bij mannelijke muizen, wat aangeeft dat hun functies bij gametenfusie niet worden gedupliceerd..Meer in het algemeen is geen van de bekende sperma-eiwitten die nodig zijn voor de adhesiefase van fusie overbodig.
Het blijft een open vraag of SPACA6 (en andere leden van de IST-superfamilie) deelnemen aan intergametische kruispunten, intragametische netwerken vormen om belangrijke eiwitten naar fusiepunten te rekruteren, of misschien zelfs fungeren als ongrijpbare fusogenen.Co-immunoprecipitatiestudies in HEK293T-cellen onthulden een interactie tussen IZUMO1 van volledige lengte en SPACA632.Onze recombinante ectodomeinen hadden echter geen interactie in vitro, wat suggereert dat de interacties die we zien in Noda et al.werden beide in het construct verwijderd (let op de cytoplasmatische staart van IZUMO1, waarvan is aangetoond dat deze niet nodig is voor bevruchting ).Als alternatief kunnen IZUMO1 en/of SPACA6 specifieke bindingsomgevingen vereisen die we in vitro niet reproduceren, zoals fysiologisch specifieke conformaties of moleculaire complexen die andere eiwitten bevatten (bekend of nog niet ontdekt).Hoewel wordt aangenomen dat het IZUMO1-ectodomein de hechting van spermatozoa aan het ei in de perivitellineruimte bemiddelt, is het doel van het SPACA6-ectodomein onduidelijk.
De structuur van SPACA6 onthult verschillende geconserveerde oppervlakken die mogelijk betrokken zijn bij eiwit-eiwitinteracties.Het geconserveerde deel van het scharniergebied onmiddellijk grenzend aan het CXXC-motief (hierboven aangeduid als Patch 1) heeft verschillende naar buiten gerichte aromatische residuen die vaak worden geassocieerd met hydrofobe en π-stapelende interacties tussen biomoleculen.De brede zijden van het Ig-achtige domein (gebied 2) vormen een positief geladen groef met sterk geconserveerde Arg- en His-residuen, en antilichamen tegen dit gebied zijn eerder gebruikt om gametenfusie te blokkeren 30 .Het antilichaam herkent het lineaire epitoop 212RIRPAQLTHRGTFS225, dat drie van de zes arginineresiduen en sterk geconserveerde His220 heeft.Het is niet duidelijk of de disfunctie te wijten is aan blokkering van deze specifieke residuen of aan de hele regio.De locatie van deze opening nabij het C-uiteinde van de β-sandwich duidt op cis-interacties met naburige sperma-eiwitten, maar niet met eiceleiwitten.Bovendien kan de retentie van een zeer flexibele, prolinerijke kluwen (plaats 3) binnen het scharnier de plaats zijn van een eiwit-eiwit-interactie of, waarschijnlijker, wijzen op het behoud van flexibiliteit tussen de twee domeinen.Geslacht is belangrijk voor de onbekende rol van SPACA6.versmelting van gameten.
SPACA6 heeft eigenschappen van intercellulaire adhesie-eiwitten, waaronder Ig-achtige β-sandwiches.Veel adhesieve eiwitten (bijvoorbeeld cadherines, integrines, adhesines en IZUMO1) bezitten een of meer β-sandwichdomeinen die eiwitten van het celmembraan uitbreiden naar hun omgevingsdoelen63,64,65.Het Ig-achtige domein van SPACA6 bevat ook een motief dat vaak wordt aangetroffen in β-sandwiches van adhesie en cohesie: doubletten van parallelle strengen aan de uiteinden van β-sandwiches, bekend als mechanische klemmen66.Er wordt aangenomen dat dit motief de weerstand tegen schuifkrachten verhoogt, wat waardevol is voor eiwitten die betrokken zijn bij intercellulaire interacties.Ondanks deze gelijkenis met adhesines is er momenteel echter geen bewijs dat SPACA6 interageert met eiwitten.Het SPACA6-ectodomein kan niet binden aan JUNO, en HEK293T-cellen die SPACA6 tot expressie brengen, zoals hier getoond, hebben nauwelijks interactie met oöcyten zonder zona 32.Als SPACA6 intergametische bindingen tot stand brengt, kunnen deze interacties post-translationele modificaties vereisen of worden gestabiliseerd door andere sperma-eiwitten.Ter ondersteuning van de laatste hypothese binden IZUMO1-deficiënte spermatozoa zich aan eicellen, wat aantoont dat andere moleculen dan IZUMO1 betrokken zijn bij de gametenadhesiestap 27 .
Veel virale, cellulaire en ontwikkelingsfusie-eiwitten hebben eigenschappen die hun functie als fusogenen voorspellen.Virale fusieglycoproteïnen (klassen I, II en III) hebben bijvoorbeeld een hydrofoob fusiepeptide of lus aan het uiteinde van het eiwit dat in het gastheermembraan is ingebracht.De hydrofiliciteitskaart van IZUMO143 en de structuur (bepaald en voorspeld) van de IST-superfamilie vertoonden geen duidelijk hydrofoob fusiepeptide.Als er dus eiwitten in de IST-superfamilie als fusogenen functioneren, doen ze dit op een manier die verschilt van andere bekende voorbeelden.
Concluderend blijven de functies van de leden van de IST-superfamilie van eiwitten geassocieerd met gametenfusie een verleidelijk mysterie.Ons gekarakteriseerde SPACA6 recombinante molecuul en de opgeloste structuur ervan zullen inzicht verschaffen in de relaties tussen deze gedeelde structuren en hun rol in gametenhechting en fusie.
De DNA-sequentie die overeenkomt met het voorspelde menselijke SPACA6-ectodomein (NCBI-toegangsnummer NP_001303901.1; residuen 27-246) werd codon-geoptimaliseerd voor expressie in Drosophila melanogaster S2-cellen en gesynthetiseerd als een genfragment met de sequentie die codeert voor Kozak (Eurofins Genomics)., het BiP-uitscheidingssignaal en de overeenkomstige 5'- en 3'-uiteinden voor ligatie-onafhankelijke klonering van dit gen in een pMT-expressievector op basis van een metallothioneïne-promoter gemodificeerd voor selectie met puromycine (pMT-puro).De pMT-puro-vector codeert voor een trombinesplitsingsplaats gevolgd door een 10x-His C-terminale tag (Figuur S2).
Stabiele transfectie van de SPACA6 pMT-puro-vector in D. melanogaster S2 (Gibco)-cellen werd uitgevoerd op vergelijkbare wijze als het protocol dat werd gebruikt voor IZUMO1 en JUNO43.S2-cellen werden ontdooid en gekweekt in Schneider's medium (Gibco) aangevuld met een eindconcentratie van 10% (v/v) door hitte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (Gibco) en 1X antimycotisch antibioticum (Gibco).Cellen uit de vroege passage (3,0 x 106 cellen) werden uitgeplaat in individuele putjes van platen met 6 putjes (Corning).Na 24 uur incubatie bij 27°C werden de cellen getransfecteerd met een mengsel van 2 mg van de SPACA6 pMT-puro-vector en Effectene-transfectiereagens (Qiagen) volgens het protocol van de fabrikant.Getransfecteerde cellen werden 72 uur geïncubeerd en vervolgens geoogst met 6 mg/ml puromycine.Cellen werden vervolgens geïsoleerd uit compleet Schneider's medium en in serumvrij Insect-XPRESS medium (Lonza) geplaatst voor grootschalige eiwitproductie.Een batch van 1 liter S2-celkweek werd gekweekt tot 8–10 x 106 ml-1 cellen in een geventileerde polypropyleen erlenmeyerkolf van 2 liter met platte bodem en vervolgens gesteriliseerd met een eindconcentratie van 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) en steriel gefilterd.geïnduceerd.De geïnduceerde kweken werden gedurende vier dagen bij 27°C en 120 rpm geïncubeerd.
Geconditioneerd medium dat SPACA6 bevatte, werd geïsoleerd door centrifugatie bij 5660 x g bij 4°C gevolgd door een Centramate tangentiële stroomfiltratiesysteem (Pall Corp) met een 10 kDa MWCO-membraan.Breng geconcentreerd medium met SPACA6 aan op een kolom van 2 ml Ni-NTA-agarosehars (Qiagen).De Ni-NTA-hars werd gewassen met 10 kolomvolumes (CV) buffer A en vervolgens werd 1 CV buffer A toegevoegd om een ​​uiteindelijke imidazoolconcentratie van 50 mM op te leveren.SPACA6 werd geëlueerd met 10 ml buffer A aangevuld met imidazool tot een eindconcentratie van 500 mM.Trombine van de restrictieklasse (Millipore Sigma) werd rechtstreeks aan de dialyseslang toegevoegd (MWCO 12-14 kDa) met 1 eenheid per mg SPACA6 versus 1 liter 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 en 150 mM NaCl (buffer B) voor dialyse.) bij 4°C gedurende 48 uur.Het door trombine gesplitste SPACA6 werd vervolgens drievoudig verdund om de zoutconcentratie te verlagen en op een 1 ml MonoS 5/50 GL kationenuitwisselingskolom (Cytiva/GE) geladen, geëquilibreerd met 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.De kationenwisselaar werd gewassen met 3 CV van 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, vervolgens werd SPACA6 geëlueerd met een lineaire gradiënt van 0 tot 500 mM NaCl in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 voor 25 CV.Na ionenuitwisselingschromatografie werd SPACA6 geconcentreerd tot 1 ml en isocratisch geëlueerd uit een ENrich SEC650 10 x 300 kolom (BioRad) geëquilibreerd met buffer B. Volgens het chromatogram werden de fracties die SPACA6 bevatten samengevoegd en geconcentreerd.De zuiverheid werd gecontroleerd door Coomassie-gekleurde elektroforese op een 16% SDS-polyacrylamidegel.De eiwitconcentratie werd gekwantificeerd door absorptie bij 280 nm met behulp van de wet van Beer-Lambert en de theoretische molaire uitdovingscoëfficiënt.
Gezuiverd SPACA6 werd gedurende de nacht gedialyseerd tegen 10 mM natriumfosfaat, pH 7,4 en 150 mM NaF en verdund tot 0,16 mg/ml voorafgaand aan analyse door middel van CD-spectroscopie.Spectrale scanning van CD's met een golflengte van 185 tot 260 nm werd verzameld op een Jasco J-1500 spectropolarimeter met behulp van kwartscuvetten met een optische weglengte van 1 mm (Helma) bij 25°C met een snelheid van 50 nm/min.De CD-spectra werden op de basislijn gecorrigeerd, gemiddeld over 10 opnames en omgezet in gemiddelde resterende ellipticiteit (θMRE) in graden cm2/dmol:
waarbij MW het molecuulgewicht van elk monster in Da is;N is het aantal aminozuren;θ is de ellipticiteit in milligraden;d komt overeen met de lengte van het optische pad in cm;eiwitconcentratie in eenheden.