310 10 * 1 mm roestvrijstalen chemische component met opgerolde buizen. De N-terminale domeinen van spidroïne vormen hydrogels op basis van amyloïde fibrillen en bieden een platform voor eiwitimmobilisatie.

Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden wij u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Sliders met drie artikelen per dia.Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door de dia's te bladeren, of de knoppen op de schuifregelaar aan het einde om door elke dia te bladeren.

Specificatie

310 Leveranciers van roestvrijstalen spiraalbuizen van 10 * 1 mm

Chemische samenstelling

Mechanische eigenschappen

Recombinante spinnenzijde-eiwitten (spinnenzijde-eiwitten) hebben veel potentiële toepassingen bij de ontwikkeling van nieuwe biomaterialen, maar hun multimodale en aggregatiegevoelige aard maakt ze moeilijk te verkrijgen en gemakkelijk te gebruiken.Hier rapporteren we dat recombinante miniatuur-spidroïne-eiwitten en, belangrijker nog, het N-terminale domein (NT) zelf snel zelfdragende en transparante hydrogels vormen bij 37 ° C.fusie-eiwitten bestaande uit NT en groen fluorescerend eiwit of purinenucleosidefosforylase vormen volledig functionele fusie-eiwitten.Hydrogels.Onze resultaten laten zien dat recombinante NT- en fusie-eiwitten hoge expressieopbrengsten opleveren en hydrogels voorzien van aantrekkelijke eigenschappen zoals transparantie, gelering zonder verknoping en directe immobilisatie van actieve eiwitten bij hoge dichtheid.
Spinnen hebben maar liefst zeven verschillende sets zijdeklieren, die elk een specifiek type zijde produceren.Alle zeven zijdesoorten zijn samengesteld uit spinnenzijde-eiwitten (spidroïnes) met een lengte van ongeveer 6000 residuen en bevatten een groot centraal herhalingsgebied omgeven door bolvormige N- en C-terminale domeinen (NT en CT)1,2.Het meest bestudeerde type zijde, de primaire ampulla, wordt geproduceerd door de primaire ampulklier.In deze klier synthetiseert een monolaag van epitheelcellen spidroïne-eiwitten en scheidt deze af in het lumen van de klier, waar ze aanwezig zijn in een oplosbare vorm (doping) in extreem hoge concentraties (30-50% w/v)3,4.Over de organisatie en conformatie van de belangrijkste ampullaire spidroïne-eiwitten in de klier is gedebatteerd, maar het meeste experimentele bewijs wijst op de aanwezigheid van een doorgaans spiraalvormige en/of willekeurige spiraalvormige conformatie en micellaire of lamellaire structuren5,6,7,8,9,10.Terwijl de repetitieve domeinen de mechanische eigenschappen van zijdevezels reguleren en β-sheet nanokristallen en amorfe structuren vormen, reguleren einddomeinen zijdevezels als reactie op veranderende omstandigheden langs de zijdeklier.Door de vorming van zijde te controleren, 19. Terminale domeinen worden evolutionair geconserveerd en hun functie kan gemeenschappelijk zijn voor alle spidroïne-eiwitten 2,20,21.Tijdens passage door de klier neemt de pH van spidroïne af van ongeveer 7,6 naar <5,716 en neemt toe met schuif- en rekwerking, gemedieerd door beweging door het geleidelijk smaller wordende kanaal.In oplossing is CT een α-helix constitutief parallel dimeer, maar als reactie op lage pH en schuifkrachten ontvouwt CT zich en schakelt β-lagen om, waardoor mogelijk β-lagen worden geactiveerd in de zich herhalende gebieden van Convert 16. NT is monomeer onder omstandigheden die de omstandigheden in het lumen van de klier weerspiegelen en de oplosbaarheid van spidroïne bemiddelen, maar bij verlaagde pH leidt protonering van een aantal carbonzuurzijketens tot dimerisatie van NT met een pKa van ongeveer 6,5, waardoor NT wordt gestabiliseerd en spidroïne in grote hoeveelheden wordt gefixeerd. hoeveelheden.netwerken16,18.NT speelt dus een sleutelrol bij de vorming van filamenten, waarbij het verandert van een monomeer in de coating naar een dimeer in de vezel23,24,25.NT blijft zeer oplosbaar en spiraalvormig onder alle tot nu toe bestudeerde omstandigheden, wat de inspiratie vormde voor de ontwikkeling ervan als een oplosbaarheidsverhogend label voor de productie van heterologe eiwitten.
Recombinant mini-spinzijde-eiwit, bestaande uit één NT, één korte herhalingsregio, één CT en een His6-tag (His-NT2RepCT) voor zuivering, is net zo oplosbaar in waterige buffer als natuurlijk spinnenzijde-eiwit en bootst de inheemse belangrijke kenmerken van zijdenspin na .dekking 25.31.His-NT2RepCT kan tot continue vezels worden gesponnen met behulp van een biomimetische machine waarin een oplosbare coating met pH 8 wordt geëxtrudeerd in een waterbad met pH 525,32,33,34,35.Bioreactorfermentatie van E. coli die His-NT2RepCT tot expressie brengt en daaropvolgende nabehandeling resulteerden na zuivering in een opbrengst van >14 g/l.De hoge opbrengst, hoge oplosbaarheid en adequate respons van His-NT2RepCT op zure omstandigheden worden allemaal toegeschreven aan NT23, 25, 34.
Hier rapporteren we de snelle vorming van transparante hydrogels uit recombinante spidroïne-eiwitten, inclusief NT alleen, door een eiwitoplossing bij 37 ° C te incuberen.Met behulp van thioflavine T-fluorescentie (ThT), Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR), nucleaire magnetische resonantiespectroscopie (NMR) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) hebben we ontdekt dat NT- en microspider-eiwitten structurele transformatie ondergaan in β-sheets en amyloïde-achtige fibrillen wanneer gels worden gevormd.Bovendien vormen fusie-eiwitten van NT en groen fluorescerend eiwit (GFP) of purinenucleosidefosforylase (PNP) hydrogels met volledig functionele fusiefragmenten.Expressie met hoge doorvoer in heterologe gastheren, gekoppeld aan snelle vorming van hydrogels onder fysiologische omstandigheden, opent de mogelijkheid van kosteneffectieve productie van hydrogels met technische functies.
In tegenstelling tot de meeste gerapporteerde recombinante spidroïne-eiwitten36, is His-NT2RepCT stabiel in Tris-HCl-buffer bij pH 8 en kan zonder neerslag worden geconcentreerd tot 500 mg/ml25.Daarom waren we verrast toen we ontdekten dat dit eiwit snel optisch heldere, zelfdragende hydrogels vormt wanneer het bij 37 ° C wordt geïncubeerd (Fig. 1b-d).Verdere studies toonden aan dat His-NT2RepCT-gelatie optrad over een breed scala aan eiwitconcentraties (10-300 mg / ml) en dat deze concentratie omgekeerd gecorreleerd was met de geleringstijd (figuur 1c en aanvullende figuur 1).Om erachter te komen welke delen van His-NT2RepCT de vorming van hydrogel mediëren, hebben we vervolgens elk domein afzonderlijk en in verschillende combinaties onderzocht met behulp van een flesinversietest (Figuur 1a, b).Alle geteste fracties van recombinant spidroïne vormden gels (bij een eiwitconcentratie van 300 mg / ml) in minder dan 1 uur, behalve geprecipiteerd 2Rep (Fig. 1b).Dit suggereert dat NT en CT alleen, in combinatie of geassocieerd met herhalingen, kunnen geleren bij 37°C en dat de His6-tag dit proces niet in significante mate beïnvloedt.Gegeven het algemene idee dat NT een zeer oplosbaar en stabiel eiwit is, en dat eerdere rapporten van recombinante spidroïnehydrogels gelatie-effecten hebben toegeschreven aan conformationele veranderingen in herhalingsgebieden en/of CT's, zou NT zelf dat ook kunnen.De ontdekking van gelering was onverwacht.Aanvullende tabel 1) 37, 38, 39. Opmerkelijk genoeg gegeleerde NT al binnen 10 minuten bij een concentratie van ≥ 300 mg/ml (Fig. 1c).Experimenten met het omkeren van injectieflacons met verschillende concentraties NT toonden aan dat bij >50 mg/ml de NT-oplossing sneller gegeleerde dan His-NT2RepCT bij de overeenkomstige concentratie (w/v, figuur 1c).
Schematische weergave van verschillende spidroïneconstructen die in dit werk zijn bestudeerd.b Geltijd bij 37 °C voor verschillende recombinante spidroïne-eiwitten (300 mg/ml), geverifieerd door het flesje om te keren.CT-gel onmiddellijk zonder incubatie (<300 mg/ml), 2Rep precipiteert (300 mg/ml, schaal van 5 mm).c Geltijd van His-NT2RepCT en NT bij aangegeven eiwitconcentraties bij 37°C.d Foto's van His-NT2RepCT- en NT-hydrogels met respectievelijk de spin en de letter "NT" eronder gedrukt (beide 200 mg/ml, schaalbalk 5 mm).
Hydrogels gevormd door verschillende recombinante spidroïne-eiwitten hebben enigszins verschillende kleuren, en observatie met het blote oog vertoont een verschillende mate van transparantie (figuur 1b).NT-gels zijn uitzonderlijk helder, terwijl andere gels ondoorzichtig worden.His-NT2RepCT- en NT-gels gegoten in cilindrische buizen konden intact uit de mal worden verwijderd (figuur 1d).
Om te testen of natuurlijke spinnenzijdecoatings geleren onder omstandigheden waarvan nu is gevonden dat ze gelering van de recombinante spidroïne-eiwitten veroorzaken, werden coatings verzameld uit de grote ampullaklier van de Zweedse brugspin (Larinioides sclopetarius).Coatings werden opgeslagen in 20 mM Tris-HCl-buffer van 50 mg / ml (gebaseerd op het gemeten drooggewicht), maar er werd geen gelering waargenomen tijdens de 21 dagen durende incubatie bij 37 ° C (aanvullende figuur 2a).
Om deze gels te kwantificeren, kunnen reologische metingen worden gebruikt om het geleringsproces te bestuderen en de algemene mechanische eigenschappen te bepalen.In het bijzonder kan het monitoren van de opslagmodulus (elasticiteit) bij verhoogde temperaturen informatie opleveren over de geleringstemperatuur en de visco-elastische eigenschappen van de coating.Experimenten met temperatuurstijging (met 1 °C/min bij 25-45 °C, gebaseerd op eerdere studies met stockoplossingen van natuurlijke zijde)40,41 lieten zien dat de opslagmoduli van His-NT2RepCT- en NT-oplossingen toenamen bij toenemende temperatuur.werd verhoogd (figuur 2 en aanvullende figuur 3).Opvallend is dat de NT-module begon te groeien bij een lagere temperatuur vergeleken met His-NT2RepCT, consistent met de snellere geltijd die werd waargenomen toen NT direct werd geïncubeerd met His-NT2RepCT bij 37°C (Figuur 1).Na een daaropvolgende temperatuurdaling keerde de opslagmodulus niet terug naar lagere waarden en bleef boven de verliesmodulus (zie aanvullende figuur 3), wat duidt op thermisch onomkeerbare stabiele gelering.Na gelering varieerde de uiteindelijke elastische modulus van 15 tot 330 kPa voor His-NT2RepCT-hydrogels bij een concentratie van 100-500 mg/ml, en de uiteindelijke elastische modulus voor NT-hydrogels (100-500 mg/ml) varieerde van 2 tot 1400. kPa (Fig. 2 en volledige hellingsgegevens) zie aanvullende figuur 3).
a Verandering in temperatuur tijdens metingen van His-NT2RepCT (300 mg/ml) en b NT (300 mg/ml) onder schudden.De pijlen geven het temperatuurverloop aan, en de lichtere arcering van de gegevens van de opslagmodule geeft testen weer bij lagere koppelwaarden voor het instrument dan gespecificeerd door de fabrikant, wat de oorzaak is van het verhoogde geluid.c Accumulatie van His-NT2RepCT en NT in de eindmodule na verhoogde temperatuur (100, 300 en 500 mg/ml).Alle modulemetingen worden gedaan met een frequentie van 0,1 Hz.
Als een mogelijke methode voor het onderzoeken van conformationele veranderingen geassocieerd met gelatie, hebben we FTIR-spectra van His-NT2RepCT en NT voor en na gelatie bij 37 ° C opgenomen (Figuur 3a, b).Zoals verwacht kwamen de spectra van His-NT2RepCT- en NT-oplossingen overeen met eiwitten die de secundaire structuur van de a-helix/willekeurige spoel vertoonden, met een uitgesproken band bij 1645 cm-1.Voor beide hydrogels resulteerde gelering in de vorming van twee armen in de middelste I-band op ongeveer 1617 cm-1 en 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), wat de vorming van antiparallelle β-sheet-structuren aangeeft.Deze veranderingen zijn ook duidelijk te zien in de respectievelijke tweede afgeleide en verschilgelatiespectra (aanvullende figuur 4b).De twee banden van de NT β-laag waren meer uitgesproken dan die van His-NT2RepCT, wat aangeeft dat het totale gehalte aan β-laagbanden in de NT-hydrogel hoger was dan dat van de NT2RepCT-hydrogel.
een FTIR-absorptiespectra van His-NT2RepCT en bNT (beide 500 mg/ml) vóór (oplossing) en na (gel)incubatie bij 37°C.c TEM-beelden van geresuspendeerde 50 mg/ml NT2RepCT-gels en dNT.Schaalbalk 200 nm.e Vezeldiameters van His-NT2RepCT en NT hydrogels.n = 100 gemeten fibrillen, p < 0,0001.De foutbalken geven de standaarddeviatie weer.Het midden van de foutbalken is het gemiddelde.Voor statistische analyse werd een ongepaarde t-test (tweezijdig) gebruikt.f ThT-fluorescentie van verschillende recombinante spidroïne-eiwitten (100 mg/ml) bij 37 °C zonder schudden.g NT (100 mg/ml) inentingsexperimenten met 100 mg/ml NT-gel met 0%, 5%, 10% en 20% zaden.
Analyse van de gel met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) toonde aan dat de hydrogel bestaat uit amyloïde-achtige fibrillen (figuren 3c, 3d).NT-gevormde fibrillen waren langwerpig (5-12 nm in diameter) en onvertakt, terwijl His-NT2RepCT-fibrillen korter van lengte waren en aanzienlijk breder in diameter (7-16 nm) (Fig. 3e).Dankzij deze resultaten konden we de kinetiek van fibrose volgen met behulp van de thioflavine T (ThT) -test.Voor alle recombinante spidroïne-eiwitten nam het fluorescentiesignaal toe wanneer monsters bij 37 ° C werden geïncubeerd (Fig. 3f, Aanvullende Fig. 5a).In overeenstemming met deze bevinding onthulde microscopisch onderzoek van NT en His-NT2RepCT onder gelerende omstandigheden een uniforme toename in ThT-fluorescentie zonder merkbare lokale accumulatie van ThT-positieve aggregaten (aanvullende figuur 5b, c).De vorming van ThT-positieve fibrillen ging niet gepaard met een toename van de NT- en His-NTCT-troebelheid (aanvullende figuur 5d), wat betekent dat een netwerk van fibrillen in de gel zich zou kunnen vormen zonder de helderheid van de gel in gevaar te brengen.Zaaien door het toevoegen van kleine hoeveelheden voorgevormde fibrillen kan de fibrillvorming van sommige amyloïden aanzienlijk versnellen42,43,44, maar door 5%, 10% of 20% (w/w) NT toe te voegen aan een oplossing van NT-hydrocoagulantia.zaaieffect (Fig. 3g).Misschien komt dit door het feit dat de fibrillen in de hydrogel relatief vast zijn en niet als zaden kunnen worden gebruikt.
Het onverwachte gedrag van recombinante spidroïne-eiwitten bij hoge temperaturen was aanleiding voor verdere nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopiestudies om conformationele veranderingen te identificeren die verband houden met gelvorming.NMR-spectra van His-NT2RepCT-oplossingen, opgenomen in de loop van de tijd bij 37 ° C, toonden aan dat CT nog steeds gedeeltelijk gevouwen was, terwijl NT- en 2Rep-signalen verdwenen waren (Fig. 4a), wat suggereert dat het voornamelijk NT en 2Rep waren die de vorming van His- NT2RepCT-hydrogel.Het CT-signaal werd ook verzwakt tot 20% van de oorspronkelijke intensiteit, wat suggereert dat CT ook grotendeels gefixeerd is en in de hydrogelstructuur is opgenomen.Voor een kleiner deel van de CT, dat net zo mobiel is als in het voorgeïncubeerde monster en dus wordt waargenomen met oplossing-NMR, missen de spectra signalen voor de eerste 10 gestructureerde residuen, mogelijk als gevolg van de moeilijke immobilisatie van het aangehechte deel van His-NT2Rep.De NMR-spectra van de -toestand van hydrogels -NT2RepCT onthulden de overheersende aanwezigheid van a-helices en β-lagen en, in mindere mate, de willekeurige spoelconformatie (Fig. 4b).Chemische verschuivingsanalyse van methionineresiduen die alleen in NT aanwezig zijn, toonde aan dat dit domein was omgezet in een β-sheetstructuur.De tijdsafhankelijke spectra van NT in oplossing vertoonden een uniforme afname in signaalintensiteit (Fig. 4c), en NMR in vaste toestand van NT-hydrogels toonde aan dat de meeste NT-residuen werden omgezet in β-sheet-structuren (Fig. 4d).De conformatie van 2Rep kon niet afzonderlijk worden bepaald vanwege de neiging tot aggregatie.De vaste stof NMR-spectra van de NTCT- en His-NT2RepCT-hydrogels leken echter erg op elkaar (Fig. 4b; Aanvullende Fig. 6b), wat suggereert dat 2Rep weinig bijdroeg aan het structurele deel van de His-NT2RepCT-hydrogel.Voor CT-hydrogels bleken α-helices, β-sheets en willekeurige spiraalvormige secundaire structuren te bestaan ​​(aanvullende figuur 6d).Dit suggereert dat sommige delen van de CT α-helices blijven, terwijl andere β-sheets worden.De resultaten van NMR-spectroscopie suggereren dus dat NT belangrijk is voor de vorming van hydrogel en ook transformeert in een β-sheet-conformatie na fusie met 2Rep en CT.In overeenstemming hiermee hebben we onlangs ontdekt dat amyloïde ruimtelijke ritsen zich waarschijnlijk in alle vijf de helices van het NT-domein vormen, en het Waltz-algoritme voorspelde een amyloïdogeen gebied in helix 1 (Fig. 4e).
2D-spectra van 15N-HSQC 10 mg/ml His-NT2RepCT-oplossing vóór (blauw) en 19 uur na incubatie (rood) bij 37°C.Individuele kruispieken in het rode spectrum en F24, G136, polyA in het blauwe spectrum worden aangegeven door aminozuursymbolen van één letter en residunummers.De inzetstukken tonen de afhankelijkheid van de signaalintensiteit van de tijd voor geselecteerde residuen uit de NT-, 2Rep- en CT-domeinen.b Radiofrequentiespectra (RFDR) in vaste toestand van His-NT2RepCT-hydrogels.Correlaties van Ca/Cβ-residuen waargenomen in RFDR-spectra werden bepaald door vergelijking met chemische verschuivingen en waarden van modelpeptiden afgeleid van statistieken en hun secundaire structuren.SSB – roterende zijband.c Eendimensionale spectra van 15N-HSQC 10 mg/ml NT-oplossing tijdens incubatie bij 37 °C gedurende 36 uur.De inzet toont de volumetrische intensiteit versus de tijd.d RFDR-spectra in vaste toestand van NT-hydrogels.De correlaties van Ca/Cβ-residuen en hun secundaire structuren waargenomen in de RFDR-spectra zijn aangegeven.e Gebaseerd op het NT45.79-fibrillatieneigingsprofiel uit de Zipper-database (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).De Rosetta-energie van het ruimtelijke bliksemverschuivingsvenster van het hexapeptide wordt weergegeven in kcal/mol.Rode balken geven hexapeptiden aan met een hoge neiging tot fibrose (Rosetta-energie lager dan -23 kcal/mol; onder de stippellijn).Groene balken geven fragmenten aan met Rosetta-energieën boven de drempelwaarde en daarom is het minder waarschijnlijk dat ze sterische ritsen vormen.Fragmenten die proline bevatten werden uitgesloten van de analyse (zonder kolommen).Vierkantjes geven gebieden aan van amyloïdose voorspeld door het Waltz-algoritme81 (https://waltz.switchlab.org).De sequentie van aminozuurresiduen van NT staat bovenaan, en de typen residuen die worden gevonden in de secundaire β-structuur (bepaald door middel van vaste-stof-NMR-spectroscopie) worden in rood weergegeven.De posities van de vijf NT α-helices worden aangeduid als (H1-H5)28.
Bij een pH <6,5 dimeriseert HT, waardoor het bestand is tegen door hitte of ureum geïnduceerde denaturatie18.Om te verduidelijken hoe de dimerisatie en stabiliteit van NT de gelvorming beïnvloeden, werden oplossingen die 100 mg/ml NT bevatten, gecontroleerd op pH 8, 7 en 6 met behulp van de injectieflaconinversietest.NT-monsters geïncubeerd bij pH 8 en 7 gegeleerd na 30 minuten bij 37 ° C, maar de pH 8-gel bleef helder, terwijl de pH 7-gel een zichtbaar neerslag vertoonde (Fig. 5a).Daarentegen vormde een oplossing die HT bij pH 6 bevatte geen gel en kon er na 20 minuten bij 37°C een groot neerslag worden waargenomen.Dit suggereert dat dimeren zelf en/of hun hogere stabiliteit vergeleken met monomeren gelvorming voorkomen.De vorming van een neerslag voor NT bij pH 7 en 6 werd niet verwacht, omdat is gerapporteerd dat NT oplosbaar is bij 200 mg/ml27, gemakkelijk opnieuw vouwt na denaturatie door hitte, en ook een α-helix behoudt bij lagere waarden van pH 18. Een waarschijnlijke verklaring voor deze discrepanties is dat de eerder gerapporteerde experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur of lager, of bij relatief lage eiwitconcentraties16,18,19.
NT-inversietest met injectieflacon (100 mg/ml) bij pH 8, 7, 6 en 154 mM NaCl (pH 8) na incubatie bij 37°C.b NT CD-spectra met respectievelijk zonder 154 mM NaF en 154 mM NaCl.Molaire ellipticiteit bij 222 nm wordt omgezet in een verhouding van natuurlijke vouwen.c NT-inversietest (100 mg/ml) NT* (37 °C en 60 °C), NTA72R (37 °C) en His-NT-L6 (37 °C en 60 °C).d CD-spectra van NT-mutanten NT*, NTA72R en His-NT-L6.Molaire ellipticiteit bij 222 nm wordt omgezet in een verhouding van natuurlijke vouwen.e Inversietest van NTFlSp, NTMiSp en gereduceerd NTMiSp (100 mg/ml).Schaalbalk 5 mm.f CD-spectra van NT, NTFlSp, NTMiSp en gereduceerd NTMiSp.Molaire ellipticiteit bij 222 nm wordt omgezet in een verhouding van natuurlijke vouwen.Volledige NT-spectra bij 25 ° C en 95 ° C worden getoond in aanvullende figuur 8.
Fysiologische zoutconcentratie bepaalt elektrostatische interacties tussen NT-subeenheden en dimerisatie van NT-overdracht naar lagere pH18.We ontdekten dat de aanwezigheid van 154 mM NaCl en NaF inderdaad respectievelijk de gelering remde (Fig. 5a, b; Aanvullende Figuur 2b) en dat deze zouten de thermische stabiliteit van NT-monomeren verhoogden (Fig. 5b, Aanvullende Figuur 8). .Het suggereert ook dat verbetering van de stabiliteit, in plaats van dimerisatie, gelvorming voorkomt.
Om de rol van eiwitdimerisatie en stabiliteit bij gelering verder te onderzoeken, hebben we twee mutanten gebruikt, NT* en NTA72R, die ook monomeer blijven bij een lage pH van 28,30.NT* is een mutant met dubbele ladingsomkering waarbij de schijnbare dipolaire ladingsverdeling van het monomeer afgevlakt is, wat dimerisatie voorkomt en de stabiliteit van het monomeer drastisch verhoogt.NTA72R is een geladen dipool, maar door Arg gesubstitueerd Ala bevindt zich op de dimeergrens, dus mutaties interfereren met subeenheidinteracties die nodig zijn voor dimerisatie.Na incubatie bij 37°C vormde NT* geen hydrogel, terwijl NTA72R gedurende 15 minuten een ondoorzichtige gel vormde (Fig. 5c).Omdat zowel NT* als NTA72R niet kunnen dimeriseren maar verschillen in monomeerstabiliteit (Fig. 5d), suggereren deze resultaten sterk dat hoge thermodynamische stabiliteit verhindert dat NT geleren.Dit wordt ook ondersteund door het feit dat HT* een gel vormt wanneer het instabiel is bij hoge temperatuur (na 8 minuten bij 60°C; figuur 5c).Eerder is aangetoond dat het hoge gehalte aan methionine in NT de natuurlijke vouwing ervan vloeibaar maakt en dat zes Met-naar-Leu-substituten (hier His-NT-L6 genoemd) het NT46-monomeer sterk stabiliseren.Gebaseerd op de aanname dat structurele flexibiliteit vereist is voor NT-gelvorming, hebben we ontdekt dat de stabiele His-NT-L6-mutant niet geleren bij 37 ° C (Figuur 5c, d).His-NT-L6 vormde echter ook een gel na incubatie gedurende 60 minuten bij 60 ° C (Fig. 5c).
Het vermogen van NT om te transformeren in β-sheetstructuren en hydrogels te vormen lijkt van toepassing te zijn op sommige, maar niet alle NT-domeinen van spidroïne.NT's van verschillende zijdesoorten en spinnensoorten, Trichonephila clavipes (NTFlSp), vormden gels ondanks hun relatief lage methioninegehalte en hoge thermische stabiliteit (Fig. 5e, f en aanvullende tabel 2).Daarentegen vormde NT van het kleine ampullar eiwit spidroïne van Araneus ventricosus (NTMiSp) met lage thermische stabiliteit en een hoog methioninegehalte geen hydrogels (aanvullende tabel 2 en figuur 5e, f).Dit laatste kan in verband worden gebracht met de aanwezigheid van intramoleculaire disulfidebindingen29,47.Wanneer de disulfidebindingen van NTMiSp werden verminderd, vormde het consequent een hydrogel na incubatie bij 37 ° C gedurende 10 minuten (Fig. 5e).Concluderend moet worden opgemerkt dat structurele flexibiliteit een belangrijk, maar niet het enige criterium is voor de vorming van een gel uit NT.Een andere factor die relevant kan zijn is de neiging om amyloïdefibrillen te vormen, en analyse met de ritsdatabase en het Waltz-algoritme toonde een correlatie aan tussen het vermogen om gels te vormen en de aanwezigheid van amyloïdogene regio's, evenals de omvang van de voorspelde regio's. om sterische ritssluitingen te vormen.Er was een correlatie (aanvullende tabel 2 en aanvullende figuur 9).
Het vermogen van NT om onder gunstige omstandigheden fibrillen en gels te vormen, bracht ons tot de hypothese dat NT-fusies met andere eiwitfragmenten nog steeds gels kunnen vormen met de volledige functie van fusiepartners.Om dit te testen, introduceerden we respectievelijk groen fluorescerend eiwit (GFP) en purinenucleosidefosforylase (PNP) aan de C-terminus van de NT.De resulterende fusie-eiwitten werden tot expressie gebracht in E. coli met zeer hoge eindopbrengsten (respectievelijk 150 mg/l en 256 mg/l schudkolfculturen voor His-NT-GFP en His-NT-PNP), consistent met wat is aangetoond. voor andere eiwitten gefuseerd met NT Ref.30. His-NT-GFP (300 mg/ml) en His-NT-PNP (100 mg/ml) fusie-eiwitten vormden gels na 2 uur en 6,5 uur bij 37°C en, belangrijker nog, de GFP-fractie bleef onveranderd.waargenomen na gelering, waarbij> 70% van de initiële fluorescentie-intensiteit overblijft na gelering (Fig. 6a).Om de PNP-activiteit in his-NT-PNP-oplossingen en -gels te meten, moesten we het fusie-eiwit verdunnen met NT omdat de enzymatische activiteit van het zuivere preparaat bij gelerende concentraties buiten het detectiebereik van de test lag.De gel gevormd met een mengsel dat 0,01 mg/ml His-NT-PNP en 100 mg/ml NT bevatte, behield 65% van de initiële enzymatische activiteit van de voorgeïncubeerde monsters (Fig. 6b).De gel bleef intact tijdens de meting (aanvullende figuur 10).
een relatieve fluorescentie-intensiteit voor en na gelering van His-NT-GFP (300 mg/ml) en omgekeerd flesje met His-NT-GFP-hydrogel (300 mg/ml) onder zichtbaar en UV-licht.Punten tonen individuele metingen (n = 3), foutbalken tonen standaardafwijking.De gemiddelde waarde wordt weergegeven in het midden van de foutbalken.b PNP-activiteit werd verkregen door fluorometrische analyse met behulp van oplossingen en gels bestaande uit NT (100 mg/ml) en een mengsel dat 0,01 mg/ml his-NT-PNP en 100 mg/ml New Taiwan dollars bevatte.De inzet toont een omgekeerd flesje met een hydrogel die His-NT-PNP bevat (schaalbalk van 5 mm).
Hier rapporteren we de vorming van hydrogels uit NT en andere recombinante spidroïne-eiwitten door een eiwitoplossing bij 37 ° C te incuberen (Figuur 1).We laten zien dat gelering geassocieerd is met de transformatie van α-helices in β-lagen en de vorming van amyloïde-achtige fibrillen (figuren 3 en 4).Deze bevinding is verrassend omdat NT’s opgerolde bolvormige bundels met vijf helixen zijn die bekend staan ​​om hun extreem hoge oplosbaarheid en hoge stabiliteit bij concentraties >200 mg/ml bij 4°C gedurende meerdere dagen27.Bovendien vouwen NT's zich gemakkelijk opnieuw op na denaturatie door hitte bij lage eiwitconcentraties in µM.Volgens onze resultaten vereist fibrilvorming een combinatie van >10 mg/ml eiwitconcentratie en een licht verhoogde temperatuur (Fig. 1).Dit komt overeen met het idee dat amyloïdefibrillen kunnen worden gevormd uit bolvormig gevouwen eiwitten die zich in een gedeeltelijk ontvouwen toestand bevinden als gevolg van thermische fluctuaties onder fysiologische omstandigheden 48 .Voorbeelden van eiwitten die deze omzetting ondergaan zijn onder meer insuline49,50, β2-microglobuline, transthyretine en lysozym51,52,53.Hoewel NT in zijn natuurlijke staat een α-helix is, is ongeveer 65% van de polypeptideketen compatibel met sterische ritssluitingvorming (Fig. 4e) 45 .Omdat het monomeer dynamisch mobiel is, kan het deze potentiële amyloïdogene gebieden blootleggen bij matig verhoogde temperaturen en kan het bij hoge concentraties totaal eiwit een kritische concentratie bereiken voor de vorming van amyloïdefibrillen.Op basis van deze redenering vonden we een negatieve correlatie tussen de spidroïneconcentratie en de geleringstijd (figuur 1c), en als de monomere NT-conformatie wordt gestabiliseerd door mutaties (NT*, His-NT-L6) of door zouttoevoeging, kan dit de vorming van vorming hydrogels (Fig. 5).
In de meeste gevallen verdwijnen amyloïdefibrillen als neerslag uit de oplossing, maar onder bepaalde omstandigheden kunnen ze hydrogels vormen55,56,57.Hydrogelvormende fibrillen hebben doorgaans een hoge aspectverhouding en vormen stabiele driedimensionale netwerken door moleculaire verstrengeling, consistent met onze resultaten.Voor hydrogelvorming in vitro worden eiwitten vaak geheel of gedeeltelijk ontvouwen, bijvoorbeeld door blootstelling aan organische oplosmiddelen, hoge temperaturen (70–90°C) en/of lage pH (1,5–3,0)59,60,61,62.De hier beschreven spidroïne-hydrogels vereisen geen agressieve verwerking, noch vereisen ze verknopingsmiddelen om de hydrogels te stabiliseren.
Eerder is gemeld dat spidroïne-herhalingen en QD's, die tijdens het spinnen van zijde β-sheet-switching lijken te ondergaan, hydrogels vormen.Vergeleken met onze bevindingen waren de incubatietijden en/of de incubatietemperaturen aanzienlijk langer of hoger, en de resulterende hydrogels waren vaak ondoorzichtig (Figuur 7 en Aanvullende Tabel 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Naast snelle geleertijden presteerden NT-hydrogels >300 mg/ml (30%) beter dan alle andere beschreven recombinante hydrogels van spinnenzijdeproteïne, evenals natuurlijke hydrogels zoals gelatine, alginaat (2%), agar (0,5% ) en collageen.(0,6%) (Figuur 7 en aanvullende tabellen 1 en 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
De geltijd en elasticiteitsmodulus van de hydrogels in dit onderzoek werden vergeleken met andere op spidroïne gebaseerde hydrogels en geselecteerde natuurlijke hydrogels.Er worden referenties gegeven samen met een beschrijving van de geleringsomstandigheden.APS Ammoniumpersulfaat, kamertemperatuur.Gegevens 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Spinnen lijken manieren te hebben ontwikkeld om te voorkomen dat spidroïne tijdens opslag geleert.Ondanks de hoge eiwitconcentratie in de zijden klier betekent het grote herhalingsgebied geassocieerd met het terminale domein dat de schijnbare concentratie van NT en CT in de klier overeenkomt met ongeveer 10-20 mg/ml, aan de grens van dit onderzoek.vereist voor in vitro waargenomen hydrogelvorming.Bovendien stabiliseerden vergelijkbare zoutconcentraties NT, zoals in zijdeklieren (Fig. 5b).NT-conformatie is onderzocht in het cytosol van E. coli en bleek strakker gevouwen te zijn dan bij onderzoek in vitro, wat verder aangeeft dat zout of andere factoren de aggregatie ervan in vivo voorkomen.Het vermogen van NTs om te transformeren in β-sheetfibrillen kan echter belangrijk zijn voor de vorming van filamenten en zou in toekomstige studies moeten worden onderzocht.
Naast de nieuwe aspecten van NT-amyloïde-achtige fibril- en hydrogelvorming die in deze studie zijn waargenomen, laten we ook zien dat dit fenomeen biotechnologische en biomedische toepassingen kan hebben (Fig. 8).Als proof of concept combineerden we NT met GFP of PNP en toonden aan dat het fusie-eiwit ook hydrogels vormt wanneer het bij 37 °C wordt geïncubeerd en dat de GFP- en PNP-fracties hun activiteit grotendeels behouden na gelering (Figuur 6).Nucleosidefosforylasen zijn belangrijke katalysatoren voor de synthese van nucleoside-analogen75, wat onze ontdekking relevant maakt voor de biofarmaceutische industrie.Het concept van het tot expressie brengen van fusie-eiwitten die onder gunstige omstandigheden transparante hydrogels vormen, maakt de creatie mogelijk van gefunctionaliseerde hydrogels met gunstige eigenschappen voor een breed scala aan toepassingen zoals enzymimmobilisatie, gecontroleerde medicijnafgifte en weefselmanipulatie.Bovendien zijn NT en NT* efficiënte expressiemarkers30, wat betekent dat NT en zijn varianten kunnen worden gebruikt voor de productie met hoge doorvoer van oplosbare fusie-eiwitten en de daaropvolgende creatie van geïmmobiliseerde doeleiwitten in 3D-hydrogels.
NT is oplosbaar, α-helisch en stabiel bij lage concentraties (μM) en 37°C.Bij dezelfde temperatuur, maar bij toenemende concentraties (>10 mg/ml), vormt NT gels bestaande uit amyloïde-achtige fibrillen.NT-fusie-eiwitten vormen ook fibrillaire gels met volledig functionele fusiefragmenten, waardoor verschillende eiwitten met behulp van NT in 3D-hydrogels kunnen worden geïmmobiliseerd.Onder: NT (VOB: 4FBS) en illustraties van glasvezelnetwerken en bijbehorende eiwitstructuren (verondersteld en niet op schaal getekend, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
De constructen (zie aanvullende tabel 4 voor een volledige lijst inclusief aminozuursequenties) werden gekloneerd in plasmide pT7 en getransformeerd in E. coli BL21 (DE3).E. coli die gemanipuleerde plasmiden bevatte, werd geïnoculeerd in Luria-bouillon aangevuld met kanamycine (70 mg/l) en overnacht gekweekt bij 30°C en 250 rpm.De kweek werd vervolgens 1/100 geïnoculeerd in LB-medium dat kanamycine bevatte en gekweekt bij 30°C en 110 rpm totdat de OD600 0,8 bereikte.Voor NMR-onderzoeken werden bacteriën gekweekt in minimaal M9-medium dat 2 g D-glucose 13C (Aldrich) en 1 g ammoniumchloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) bevatte voor eiwitlabeling met isotopen.Verlaag de temperatuur tot 20 graden Celsius en induceer eiwitexpressie met 0,15 mM isopropylthiogalactopyranoside (eindconcentratie).Na eiwitexpressie gedurende de nacht werden de cellen gedurende 20 minuten bij 7278 x g, 4°C geoogst.Celpellets werden opnieuw gesuspendeerd in 20 mM Tris-HCl, pH 8, en bevroren tot verder gebruik.Ontdooide cellen werden gelyseerd met behulp van een celdisruptor (machines uit de TS-serie, Constant Systems Limited, Engeland) bij 30 kPa.Vervolgens werden de lysaten gedurende 30 minuten bij 4°C bij 25.000 g gecentrifugeerd.Voor NTMiSp werd de pellet vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 2 M ureum, 20 mM Tris-HCl, pH 8, en gedurende 2 minuten gesoniceerd (2 s aan/uit, 65%), en vervolgens opnieuw gecentrifugeerd bij 25.000 xg, 4 ° C. 30 minuten.Het supernatant werd op een Ni-NTA-kolom geladen, gewassen met 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazool, pH 8, en uiteindelijk werd het eiwit geëlueerd met 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazool, pH 8. Om NT2RepCT en NTCT, trombinedigestie introduceert de plaats (ThrCleav) tussen His en NT.Trombinesplitsingsplaatsen zijn ook aanwezig in His-NT-ThrCleav-2Rep (produceert 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produceert NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produceert CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produceert NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produceert NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produceert NTF1Sp) en His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produceert NTMiSp).De constructen werden gedigereerd met trombine (1:1000) en overnacht bij 4°C gedialyseerd met 20 mM Tris-HCl, pH 8, met behulp van een Spectra/Por-dialysemembraan met een molecuulgewichtsdrempel van 6-8 kDa.Na dialyse wordt de oplossing op een Ni-NTA-kolom geladen en wordt het effluent dat het beoogde eiwit bevat, verzameld.Eiwitconcentraties werden bepaald door de UV-absorptie bij 280 nm te meten met behulp van de uitdovingscoëfficiënt van elk eiwit, behalve NTF1Sp, waarvoor de Bradford-test werd gebruikt volgens het protocol van de fabrikant.De zuiverheid werd bepaald door SDS-polyacrylamide (4-20%) gelelektroforese en Coomassie briljante blauwe kleuring.Eiwitten werden geconcentreerd met behulp van centrifugefilters (VivaSpin 20, GE Healthcare) bij 4000 xg met een grenswaarde voor het molecuulgewicht van 10 kDa in cycli van 20 minuten.
Ontdooi de eiwitoplossing en pipetteer voorzichtig 150 µl in een helder septumflacon van 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).De buizen werden afgedekt en afgesloten met parafilm om verdamping te voorkomen.Monsters (n = 3) werden bij 37°C of 60°C geïncubeerd en periodiek omgekeerd om gelering waar te nemen.Monsters die niet geleren werden gedurende ten minste één week geïncubeerd.Verminder NTMiSp-disulfidebindingen met 10 mM DTT per 10 μM eiwit.Om de gelering van natuurlijke spinnenzijdecoatings te analyseren, werd de Zweedse brugspin doorgesneden, de twee belangrijkste geampuleerde klieren werden in 200 μl 20 mM Tris-HCl-buffer pH 8 geplaatst en gesneden om de coating van de klieren te laten scheiden..De inhoud van de klieren wordt opgelost in buffer, 50 µl voor bepaling van het drooggewicht (door incubatie van open flesjes bij 60 °C tot constant gewicht) en 150 µl voor gelering bij 37 °C.
De meetgeometrie/gereedschap is gemaakt van roestvrij staal met behulp van een parallelle plaat met een topdiameter van 20 mm en een spleet van 0,5 mm.Verwarm het monster van 25 °C naar 45 °C en terug naar 25 °C met een snelheid van 1 °C per minuut met behulp van een Peltier-plaat met roestvrijstalen bodem.Trillingsmetingen werden uitgevoerd met een frequentie van 0,1 Hz en in het lineaire visco-elastische gebied van het materiaal met een spanning van 5% en 0,5% voor monsters van respectievelijk 100 mg/ml en 300-500 mg/ml.Gebruik een aangepaste vochtigheidskamer om verdamping te voorkomen.Gegevens werden geanalyseerd met behulp van Prism 9.
Voor het verzamelen van infraroodspectra (IR) bij kamertemperatuur van 800 tot 3900 cm–1.Het ATR-apparaat, evenals het lichtpad door de spectrometer, wordt voor en tijdens het experiment gespoeld met droge, gefilterde lucht.Oplossingen (500 mg/ml om waterabsorptiepieken in de spectra te minimaliseren) werden op de kristallen gepipetteerd en voorafgaand aan de meting werden gels (500 mg/ml) gevormd en vervolgens overgebracht naar de kristallen (n = 3).Er werden 1000 scans opgenomen met een resolutie van 2 cm-1 en een nul-duty-cycle van 2. De tweede afgeleide werd berekend met behulp van OPUS (Bruker) met een afvlakkingsbereik van negen punten.De spectra werden genormaliseerd naar hetzelfde integratiegebied tussen 1720 en 1580 cm-1 met behulp van F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopie Software”.Bij ATR-IR-spectroscopie is de penetratiediepte van een infraroodstraal in een monster afhankelijk van het golfgetal, wat resulteert in een sterkere absorptie bij lagere golfgetallen dan bij hogere golfgetallen.Deze effecten zijn niet gecorrigeerd voor de spectra getoond in Fig.3 omdat ze erg klein zijn (aanvullende figuur 4).Gecorrigeerde spectra voor dit cijfer werden berekend met behulp van de Bruker OPUS-software.
In principe is een uitgebreide kwantificering van eiwitconformaties mogelijk na betrouwbare deconvolutie van de componenten binnen de amide I-piek.In de praktijk doen zich echter enkele obstakels voor.Ruis in het spectrum kan tijdens deconvolutie als (valse) pieken verschijnen.Bovendien valt de piek als gevolg van waterbuiging samen met de positie van de amide I-piek en kan deze een vergelijkbare grootte hebben voor monsters die een grote hoeveelheid water bevatten, zoals de hier bestudeerde waterige gel.Daarom hebben we niet geprobeerd de amide I-piek volledig te ontleden, en onze waarnemingen moeten alleen worden overwogen ter ondersteuning van andere methoden zoals NMR-spectroscopie.
Oplossingen van 50 mg/ml NT en His-NT2RepCT werden overnacht bij 37°C gegeleerd.De hydrogel werd vervolgens verdund met 20 mM Tris-HCl (pH 8) tot een concentratie van 12,5 mg/ml, goed geschud en gepipetteerd om de gel te breken.Vervolgens werd de hydrogel 10 keer verdund met 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl van het monster werd aangebracht op een koperen rooster bedekt met formvar en het overtollige monster werd verwijderd met vloeipapier.Monsters werden tweemaal gewassen met 5 µl MilliQ-water en gedurende 5 minuten gekleurd met 1% uranylformiaat.Verwijder overtollige vlekken met absorberend papier en laat het gaas vervolgens aan de lucht drogen.Op deze netwerken werd beeldvorming uitgevoerd met behulp van een FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN die op 100 kV werkte.De beelden zijn opgenomen met een vergroting van x 26.500 en x 43.000 met behulp van een Veleta 2k x 2k CCD-camera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Duitsland).Voor elk monster (n = 1) werden 10–15 beelden opgenomen.ImageJ (//imagej.nih.gov/) werd gebruikt voor beeldanalyse en meting van vezeldiameters (n = 100, verschillende vezels).Prisma 9 werd gebruikt om ongepaarde t-tests uit te voeren (tweezijdig).De gemiddelde His-NT2RepCT- en NT-fibrillen waren respectievelijk 11,43 (SD 2,035) en 7,67 (SD 1,389) nm.Het betrouwbaarheidsinterval (95%) is -4,246 tot -3,275.vrijheidsgraden = 198, p < 0,0001.
80 µl vloeibare monsters die 10 µM thioflavine T (ThT) bevatten, werden in drievoud gemeten (n = 3) onder statische omstandigheden met behulp van Corning-platen met 96 putjes en heldere bodem met zwarte bodem (Corning Glass 3881, VS).Fluorescentieverschillen werden geregistreerd met behulp van een excitatiefilter van 440 nm en een emissiefilter van 480 nm (FLUOStar Galaxy van BMG Labtech, Offenburg, Duitsland).Het ThT-signaal was noch verzadigd noch uitgedoofd, omdat experimenten met verschillende ThT-concentraties werden uitgevoerd zonder de signaalintensiteit te veranderen.Registreer de absorptie bij 360 nm voor waasmeting.Voor zaaiexperimenten werden 100 mg/ml gels gevormd bij 37°C, geresuspendeerd en gebruikt voor zaaien bij molaire verhoudingen van 5%, 10% en 20%.Gegevens werden geanalyseerd met behulp van Prism 9.
Ontdooi de voorraden His-NT2RepCT en NT >100 mg/ml op ijs en filtreer door een filter van 0,22 µm.Concentraties werden berekend door de absorptie bij 280 nm te meten met behulp van Nanodrop.In putjes van een zwarte niet-bindende plaat met 96 putjes (Corning) met een heldere bodem werden de monsters verdund tot 20 mg/ml in 20 mM Tris-HCl pH 8 en gemengd met 5 μM ThT (eindconcentratie), totale monsterconcentratie 50 μl volume.Monsters werden elke 10 minuten bij 37 ° C afgebeeld op een CellObserver (Zeiss) microscoop met doorgelaten lichtkanaal en FITC-excitatie- en emissiefiltersets voor ThT-beeldvorming.Voor de beeldvorming wordt een 20x/0,4-lens gebruikt.Zen Blue (Zeiss) en ImageJ (//imagej.nih.gov/) werden gebruikt voor beeldanalyse.Er werden ook gels bereid uit NT- en His-NT2RepCT-oplossingen in een concentratie van 50 mg/ml die 20 mM Tris pH 8 en 5 µM ThT bevatten en gedurende 90 minuten bij 37°C geïncubeerd.De gelstukken werden overgebracht naar een nieuw putje dat 20 mM Tris, pH 8 en 5 μM ThT bevatte in een niet-bindende zwarte, heldere bodemplaat met 96 putjes.Verkrijg groene fluorescentie en helderveldbeelden met een vergroting van 20x/0,4.ImageJ werd gebruikt voor beeldanalyse.
Oplossing NMR-spectra werden verkregen bij 310 K op een 600 MHz Bruker Avance Neo-spectrometer uitgerust met een QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR-monsters die 10 mg/ml homogeen eiwit bevatten, gelabeld met 13C, 15N, opgelost in 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Chemische verschuivingen van NT2RepCT bij pH 6,7 werden gebruikt om piek 23 in het 2D-spectrum van 15N-HSQC toe te wijzen.
Magische hoekdraaiende vaste NMR (MAS)-spectra van 13C, 15N-gelabelde hydrogels werden opgenomen op een Bruker Avance III HD-spectrometer bij 800 MHz uitgerust met een 3,2 mm 13C/15N{1H} elektronenloze sonde.De monstertemperatuur werd geregeld met behulp van een gasstroom met variabele temperatuur bij 277 K. Tweedimensionale dipoolrotatieresonantie (DARR) en radiofrequentieherverbindingsspectra (RFDR) werden verkregen bij MAS-frequenties van respectievelijk 12, 5 kHz en 20 kHz.Kruispolarisatie (CP) van 1H naar 13C werd uitgevoerd met behulp van een lineaire helling van 60,0 naar 48,0 kHz bij 1H, 61,3/71,6 kHz bij 13C (bij 12,5/20 kHz MAS) en een contacttijd van 0,5–1 ms.Tijdens het verzamelen van gegevens werd Spinal6478-ontkoppeling bij 73,5 kHz gebruikt.De acquisitietijd was 10 milliseconden en de cyclusvertraging was 2,5 seconden.De enkelvoudig gekoppelde Ca/Cβ-correlaties waargenomen in de RFDR-spectra werden toegewezen op basis van de karakteristieke chemische verschuivingen van het residutype en meervoudig gekoppelde correlaties in de DARR-spectra.
De Zipper79-database (//services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) werd gebruikt om fluttertendensen en Rosetta-energie voor NT, NTFlSp en NTMiSp te evalueren.De Zipper-database berekent Rosetta Energy80, die verschillende vrije energiefuncties combineert om de eiwitstructuur te modelleren en analyseren.Een energieniveau van -23 kcal/mol of lager duidt op een sterke neiging tot fibrilleren.De lagere energie betekent meer stabiliteit van de twee β-strengen in de ritssluitingconformatie.Bovendien werd het Waltz-algoritme gebruikt om amyloïdogene regio's in NT, NTFlSp en NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
De NT-eiwitoplossing werd gemengd met 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur (MES)-buffer bij pH 5,5 en 6,0 om de pH te verlagen tot respectievelijk pH 6 en 7.De uiteindelijke eiwitconcentratie was 100 mg/ml.
Metingen werden uitgevoerd op een J-1500 CD-spectrometer (JASCO, VS) met behulp van een cuvet van 300 μl met een optisch pad van 0,1 cm.Eiwitten werden verdund tot 10 μM (n = 1) in 20 mM fosfaatbuffer (pH 8).Om de eiwitstabiliteit in aanwezigheid van zout te analyseren, werden eiwitten geanalyseerd bij dezelfde concentratie (n = 1) in 20 mM fosfaatbuffer (pH 8) die respectievelijk 154 mM NaF of NaCl bevatte.Temperatuurscans werden opgenomen bij 222 nm van 25°C tot 95°C met een verwarmingssnelheid van 1°C/min.Het aandeel natuurlijk gevouwen eiwitten werd berekend met behulp van de formule (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Bovendien werden voor elk monster vijf spectra geregistreerd van 260 nm tot 190 nm bij 25°C en na verwarming tot 95°C.Vijf spectra werden gemiddeld, afgevlakt en omgezet in molaire ellipticiteit.Gegevens werden geanalyseerd met behulp van Prism 9.
De fluorescentie-intensiteit van His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µl) werd in drievoud gemeten (n = 3) in Corning-platen met 96 putjes en een zwarte transparante bodem (Corning Glass 3881, VS) onder statische omstandigheden.Meet monsters met een op fluorescentie gebaseerde plaatlezer met een excitatiegolflengte van 395 nm en registreer de emissie bij 509 nm vóór gelering en 2 uur later bij 37 °C.Gegevens werden geanalyseerd met Prism 9.
Purinenucleosidefosforylase-activiteitstestkit (fluorometrische methode, Sigma Aldrich) werd gebruikt volgens de instructies van de fabrikant.Om de activiteit te meten in gels en oplossingen die His-NT-PNP bevatten, mengt u 10 ng His-NT-PNP met 100 mg/ml NT tot een totaal volume van 2 µl, omdat de gel een signaal gaf boven het detectie-interval van de set.Controles voor gels en oplossingen zonder His-NT-PNP waren inbegrepen.De metingen zijn tweemaal uitgevoerd (n = 2).Nadat de activiteit was gemeten, werd het reactiemengsel verwijderd en de gel gefotografeerd om er zeker van te zijn dat de gel tijdens de meting intact bleef.Gegevens werden geanalyseerd met behulp van Prism 9.
Voor meer informatie over het ontwerp van onderzoeken, zie de Nature-studiesamenvatting die bij dit artikel is gelinkt.
Figuren 1 en 2 presenteren de initiële gegevens.1c, 2a – c, 3a, b, e – g, 4, 5b, d, f en 6, aanvullende figuren.3, aanvullende afb.5a, d, aanvullende afb.6 en aanvullende afb.8. Gegevens Gegevens uit dit onderzoek worden gehost in de Zenodo-database https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.De in dit onderzoek verkregen NMR-gegevens werden in de BMRBig-repository geplaatst onder de invoer-ID bmrbig36.De structuren van GFP en PNP zijn afkomstig uit PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. en Johansson, J. Spinnen van kunstmatige spinnenzijde.Nationale chemische stof.biologie.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Het Nephila clavipes-genoom benadrukt de diversiteit van spinnenzijde-genen en hun complexe expressie.Nationale Genet.49, 895-903 (2017).