347 12,7 * 1,24 mm roestvrijstalen spiraalbuizen, moleculair mechanisme van synchrone elektrostatische condensatie en coaggregatie van α-synucleïne en tau

Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden wij u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Sliders met drie artikelen per dia.Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door de dia's te bladeren, of de knoppen op de schuifregelaar aan het einde om door elke dia te bladeren.

347 roestvrijstalen buisspecificatie

347 12,7 * 1,24 mm roestvrijstalen spiraalbuis

Buitendiameter: 6,00 mm buitendiameter tot 914,4 mm buitendiameter, maten tot 24” NB beschikbaar uit voorraad, buitendiameter stalen buizen beschikbaar uit voorraad

SS 347 buisdiktebereik: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
GEWICHT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, enz. (0,5-12 mm) Of niet-reguliere afmetingen die naar wens op maat kunnen worden gemaakt

Type: RVS 347 Naadloze Buizen |RVS 347 ERW-buizen |RVS 347 gelaste buizen |RVS 347 Gefabriceerde buizen |SS 347 CDW-buizen, LSAW-buizen / naadgelast / opnieuw getekend

Vorm: SS 347 Ronde buizen/buizen, SS 347 Vierkante buizen/buizen, SS 347 Rechthoekige buizen/buizen, SS 347 Spiraalbuizen, SS 347 “U”-vorm, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulische buizen

Lengte: enkel willekeurig, dubbel willekeurig en vereiste lengte. Einde: gewoon uiteinde, afgeschuind uiteinde, geprofileerd

Eindbescherming: Plastic doppen |Buitenafwerking: 2B, nr. 4, nr. 1, nr. 8 spiegelafwerking voor roestvrijstalen buizen, afwerking volgens klantvereisten

Leveringsconditie: gegloeid en gebeitst, gepolijst, helder gegloeid, koudgetrokken

Inspectie, testrapporten: testcertificaten van fabrieken, EN 10204 3.1, chemische rapporten, mechanische rapporten, PMI-testrapporten, visuele inspectierapporten, inspectierapporten van derden, door NABL goedgekeurde laboratoriumrapporten, destructief testrapport, niet-destructieve testrapporten

Verpakking: Verpakt in houten kisten, plastic zakken, gebundelde stalen strips of volgens klantverzoeken

Bijzonderheden: Andere maten en specificaties dan hierboven zijn op aanvraag te vervaardigen

SS 347 Pijpmaatbereik: 1/2 inch NB, OD tot 24 inch

ASTM A312 347: Naadloos en met rechte naden gelaste austenitische buizen bedoeld voor hoge temperaturen en algemene corrosieve toepassingen.Toevoegmetaal niet toegestaan ​​tijdens het lassen.

ASTM A358 347: Elektrisch smeltgelaste austenitische buis voor corrosieve en/of hoge temperaturen.Normaal gesproken worden volgens deze specificatie alleen buizen tot 8 inch geproduceerd.Toevoeging van vulmetaal tijdens het lassen is toegestaan.

ASTM A790 347: Naadloos en met rechte naad gelaste ferritische/austenitische (duplex) buis bedoeld voor algemene corrosieve toepassingen, met een bijzondere nadruk op weerstand tegen spanningscorrosie.

ASTM A409 347: Elektrische smeltgelaste austenitische lichtwandige buis met rechte of spiraalnaad met grote diameter in de maten 14” tot 30” met wanden Sch5S en Sch 10S voor corrosief en/of hoog

ASTM A376 347: Naadloze austenitische buis voor toepassingen bij hoge temperaturen.

ASTM A813 347: Enkel- of dubbelgelaste austenitische buis met enkele naad voor hoge temperaturen en algemene corrosieve toepassingen.

ASTM A814 347: Koudbewerkte gelaste austenitische buis voor hoge temperaturen en algemene corrosieve toepassingen.

347H roestvrijstalen buizen Chemische samenstelling

Mechanische eigenschappen van roestvrijstalen 347H-buizen

Roestvrijstalen 347H-buizen Fysieke eigenschappen

Equivalente kwaliteiten voor 347H roestvrijstalen buis

Amyloïde alfa-synucleïne (αS)-aggregatie is een kenmerk van de ziekte van Parkinson en andere synucleinopathieën.Onlangs is het tau-eiwit dat gewoonlijk wordt geassocieerd met de ziekte van Alzheimer in verband gebracht met αS-pathologie en co-lokaliseert het in αS-rijke insluitsels, hoewel het moleculaire mechanisme van coaggregatie van de twee eiwitten onduidelijk blijft.We rapporteren hier dat de αS-fase zich scheidt in vloeibare condensaten via elektrostatische complexe condensatie met positief geladen polypeptiden zoals tau.Afhankelijk van de affiniteit van αS voor polykationen en de snelheid van valentie-uitputting van het coagulatienetwerk, ondergaan stolsels snelle gelering of coalescentie gevolgd door langzame amyloïdeaggregatie.Door een reeks geavanceerde biofysische technieken te combineren, konden we de vloeistof-vloeistof αS/Tau-fasescheiding karakteriseren en de sleutelfactoren identificeren die leiden tot de vorming van heterogene aggregaten die beide eiwitten in een vloeibaar eiwitcondensaat bevatten.
Naast membraancompartimenten kan ruimtelijke scheiding in cellen ook worden bereikt door de vorming van eiwitrijke, vloeistofachtige dichte lichamen, biomoleculaire condensaten of druppeltjes genoemd, via een proces dat bekend staat als vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS).Deze druppeltjes worden gevormd door multivalente temporele interacties, meestal tussen eiwitten of eiwitten en RNA, en vervullen een verscheidenheid aan functies in bijna alle levende systemen.Een groot aantal LLP-compatibele eiwitten vertonen sequenties van lage complexiteit die zeer ongeordend van aard zijn en wat betreft de vorming van biomoleculaire condensaten3,4,5.Talrijke experimentele onderzoeken hebben de flexibele, vaak ongeordende en multivalente aard van de eiwitten waaruit deze vloeistofachtige condensaten bestaan, aan het licht gebracht, hoewel er weinig bekend is over de specifieke moleculaire determinanten die de groei en rijping van deze condensaten tot een meer vaste stof controleren. staat..
De nieuwe gegevens ondersteunen de hypothese dat afwijkende eiwitgestuurde LLPS en transformatie van druppeltjes in vaste structuren relevante cellulaire routes kunnen zijn die leiden tot de vorming van onoplosbare toxische aggregaten die vaak kenmerken zijn van degeneratieve ziekten.Veel LLPS-geassocieerde intrinsiek ongeordende eiwitten (IDP's), vaak sterk geladen en flexibel, worden al lang in verband gebracht met neurodegeneratie via het proces van amyloïdeaggregatie.In het bijzonder is aangetoond dat biomoleculaire IDP-condensaten zoals FUS7 of TDP-438 of eiwitten met grote domeinen met lage complexiteit, zoals hnRNPA19, verouderen tot gelachtige of zelfs vaste vormen via een proces dat fluïdisatie wordt genoemd.verbinding.naar solid-phase transition (LSPT) als functie van de tijd of als reactie op bepaalde post-translationele modificaties of pathologisch significante mutaties1,7.
Een andere IDP geassocieerd met LLPS in vivo is Tau, een met microtubuli geassocieerd ongeordend eiwit waarvan de amyloïde aggregatie betrokken is bij de ziekte van Alzheimer10, maar recentelijk ook betrokken is bij de ziekte van Parkinson (PD) en andere synaptische nucleaire proteïnopathieën11, 12, 13 die hiermee verband houden.Er is aangetoond dat Tau spontaan dissocieert van oplossing/cytoplasma als gevolg van gunstige elektrostatische interacties14, resulterend in de vorming van met tau verrijkte druppeltjes die bekend staan ​​als elektrostatische coacervaten.Er is ook waargenomen dat dit soort niet-specifieke interactie de drijvende kracht is achter veel biomoleculaire condensaten in de natuur15.In het geval van een tau-eiwit kan elektrostatische aggregatie worden gevormd door eenvoudige aggregatie, waarbij tegengesteld geladen gebieden van het eiwit het splitsingsproces in gang zetten, of door complexe aggregatie door interactie met negatief geladen polymeren zoals RNA.
Onlangs is α-synucleïne (αS), een amyloïde IDP betrokken bij Parkinson en andere neurodegeneratieve ziekten, gezamenlijk bekend als synucleinopathie17,18, aangetoond in cellulaire en diermodellen19,20 geconcentreerd in eiwitcondensaten met vloeistofachtig gedrag.In vitro studies hebben aangetoond dat αS LLPS ondergaat door eenvoudige aggregatie via overwegend hydrofobe interacties, hoewel dit proces uitzonderlijk hoge eiwitconcentraties en atypisch lange incubatietijden vereist .Of de αS-bevattende condensaten die in vivo worden waargenomen, door deze of andere LLPS-processen worden gevormd, blijft een belangrijk onopgelost probleem.Ook al is αS-amyloïdaggregatie waargenomen in neuronen bij Parkinson en andere synucleinopathieën, het exacte mechanisme waardoor αS intracellulaire amyloïdaggregatie ondergaat, blijft onduidelijk, aangezien overexpressie van dit eiwit dit proces niet op zichzelf lijkt te veroorzaken.Vaak is aanvullende cellulaire schade vereist, wat erop wijst dat bepaalde cellulaire locaties of micro-omgevingen nodig zijn voor de renucleatie van intracellulaire αS-amyloïde assemblages.Eén cellulaire omgeving die bijzonder gevoelig is voor aggregatie kan de binnenkant van eiwitcondensaten zijn 23 .
Interessant is dat is gevonden dat αS en tau co-lokaliseren in karakteristieke ziekte-insluitsels bij mensen met de ziekte van Parkinson en andere synucleinopathieën 24,25 en experimenten hebben een synergetische pathologische relatie tussen de twee eiwitten gerapporteerd 26,27 wat een mogelijke relatie suggereert tussen aggregatie αS en tau bij neurodegeneratieve ziekten.ziekte.Er is gevonden dat aS en tau een interactie aangaan en elkaars aggregatie in vitro en in vivo bevorderen 28,29 en heterogene aggregaten bestaande uit deze twee eiwitten zijn waargenomen in de hersenen van patiënten met synucleinopathieën 30 .Er is echter weinig bekend over de moleculaire basis van de interactie tussen αS en tau en het mechanisme van de co-aggregatie ervan.Er is gerapporteerd dat αS een interactie aangaat met tau via een elektrostatische aantrekking tussen het sterk negatief geladen C-terminale gebied van αS en het centrale prolinerijke gebied van tau, dat ook verrijkt is aan positief geladen residuen.
In deze studie laten we zien dat αS inderdaad kan dissociëren in druppeltjes via elektrostatische complexcondensatie in de aanwezigheid van tau-eiwit, in tegenstelling tot de interactie ervan met andere positief geladen polypeptiden zoals poly-L-lysine (pLK), en in dit proces .αS fungeert als een steigermolecuul voor het druppelnetwerk.We hebben merkbare verschillen geïdentificeerd in het rijpingsproces van elektrostatische αS-coacervaten, die verband houden met verschillen in de valentie en sterkte van de interactie van eiwitten die betrokken zijn bij het coacervaatnetwerk.Interessant is dat we co-aggregatie van αS- en tau-amyloïde eiwitten in langlevende vloeibare coacervaten hebben waargenomen en enkele sleutelfactoren hebben geïdentificeerd die leiden tot co-aggregatie van deze twee eiwitten in dergelijke coacervaten.Hier beschrijven we in detail dit proces, dat een mogelijk moleculair mechanisme is dat ten grondslag ligt aan de colocalisatie van twee eiwitten in ziektespecifieke insluitsels.
αS heeft een zeer anionische C-terminale staart bij neutrale pH (Fig. La), en we veronderstelden dat het LLPS zou kunnen ondergaan door de condensatie van elektrostatische complexen met polykationische ongeordende polypeptidemoleculen.We gebruikten een poly-L-lysine (pLK) met 100 residuen als het startmodelmolecuul vanwege de positief geladen en ongeordende polymere aard ervan bij neutrale pH 32. Ten eerste bevestigden we dat pLK interageert met het Ct-domein van αS via oplossing-NMR-spectroscopie (Figuur 1b) met behulp van 13C/15N-gelabeld aS in de aanwezigheid van toenemende molaire verhoudingen van aS:pLK.De interactie van pLK met het Ct-domein van aS manifesteert zich in verstoringen van de chemische verschuiving en een afname van de piekintensiteit in dit gebied van het eiwit.Interessant is dat toen we αS met pLK mengden bij een αS-concentratie van ongeveer.5–25 µM in aanwezigheid van polyethyleenglycol (5–15% PEG-8) (typische LLPS-buffer: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) gingen we onmiddellijk door een breed veld van eiwitvorming .druppeltjes werden waargenomen met behulp van fluorescentie (WF) en helderveld (BF) microscopie (Fig. 1c).Druppeltjes van 1-5 µm die geconcentreerd αS bevatten (1 µM AlexaFluor488-gelabeld αS, AF488-αS toegevoegd), hun elektrostatische eigenschappen kunnen worden afgeleid van hun weerstand tegen 10% 1,6-hexaandiol (1,6-HD) en de gevoeligheid ervan voor een toename van de NaCl-concentratie (Fig. 1c).De vloeistofachtige aard van de coacervaten van het aS / pLK-elektrostatische complex wordt gedemonstreerd door hun vermogen om binnen milliseconden te fuseren (figuur 1d).Met behulp van turbidimetrie hebben we de vorming van druppels onder deze omstandigheden gekwantificeerd, de elektrostatische aard van de belangrijkste interactie bevestigd die verband houdt met de stabiliteit ervan (figuur 1e) en het effect van verschillende polymeerverhoudingen op het LLPS-proces geëvalueerd (figuur 1f).Hoewel druppelvorming wordt waargenomen over een breed scala aan polymeerverhoudingen, is het proces zeer gunstig wanneer pLK groter is dan aS.LLP's zijn ook waargenomen met behulp van het chemisch verschillende verdringingsmiddel dextran-70 (70 kDa) of met behulp van een verscheidenheid aan monsterformaten, waaronder druppels van glasplaatjes, microplaatputjes van verschillende materialen, Eppendorf- of kwartscapillairen.
een schematische weergave van verschillende eiwitregio's in de WT-αS- en ΔCt-αS-varianten die in dit onderzoek zijn gebruikt.Het amfipathische N-terminale domein, het hydrofobe amyloïdevormende (NAC) gebied en het negatief geladen C-terminale domein worden respectievelijk weergegeven in blauw, oranje en rood.De Net Charge Per Residual (NCPR)-kaart van WT-αS wordt weergegeven.b NMR-analyse van de αS/pLK-interactie in afwezigheid van macromoleculaire klonten.Naarmate de pLK-concentratie toeneemt (de molaire verhoudingen van aS:pLK van 1:0,5, 1:1,5 en 1:10 worden respectievelijk weergegeven in lichtgroen, groen en donkergroen).c Coacervaat αS/pLK (molaire verhouding 1:10) bij 25 µM (1 µM AF488-gelabeld αS of Atto647N-gelabeld pLK voor WF-beeldvorming) in LLPS-buffer (boven) of aangevuld met 500 mM NaCl (linksonder) of na 10 minuten % 1,6-hexaandiol (1,6-HD; rechtsonder).Schaalbalk = 20 µm.d Representatieve microscopische beelden van BF-druppelfusie van αS/pLK (molaire verhouding 1:10) bij een concentratie van 25 μM;pijlen geven het samenvoegen van individuele druppels (rode en gele pijlen) aan tot een nieuwe druppel (oranje pijl) binnen 200 ms).Schaalbalk = 20 µm.e Lichtverstrooiing (bij 350 nm) αS/pLK-aggregatie in LLPS-buffer voor en na toevoeging van 500 mM NaCl of 10% 1,6-HD bij 25 µM αS (N = 3 monsterreplica's, gemiddelde en standaardafwijking ook aangegeven).f BF-afbeelding (boven) en lichtverstrooiingsanalyse (bij 350 nm, onder) van αS / pLK-aggregatie bij 25 μM αS met toenemende αS: pLK molaire verhouding (N = 3 monsterreplica's, gemiddelde en standaardafwijking ook aangegeven).Schaalbalk = 10 µm.De schaalbalk op één afbeelding geeft de schaal aan van alle afbeeldingen in één paneel.Ruwe gegevens worden aangeleverd in de vorm van onbewerkte gegevensbestanden.
Gebaseerd op onze observaties van αS/pLK elektrostatische complexe condensatie en eerdere observaties van αS als een cliëntmolecuul van het tau/RNA-condensaat door directe interactie met tau31, veronderstelden we dat αS en tau samen met het oplosmiddel zouden kunnen segregeren in afwezigheid van RNA condensatie.via elektrostatische complexen, en αS is het scaffold-eiwit in αS / Tau-coacervaten (zie tau-ladingsverdeling in Figuur 2e).We hebben waargenomen dat wanneer 10 μM αS en 10 μM Tau441 (met respectievelijk 1 μM AF488-αS en 1 μM Atto647N-Tau) met elkaar werden gemengd in LLPS-buffer, ze gemakkelijk eiwitaggregaten vormden die beide eiwitten bevatten, zoals gezien door WF-microscopie.(Afb. 2a).De colocalisatie van de twee eiwitten in de druppeltjes werd bevestigd door confocale (CF) microscopie (aanvullende figuur la).Soortgelijk gedrag werd waargenomen wanneer dextran-70 werd gebruikt als aggregatiemiddel (aanvullende figuur 1c).Met behulp van FITC-gelabeld PEG of dextran ontdekten we dat beide crowding-agentia gelijkmatig over de monsters waren verdeeld en geen segregatie of associatie vertoonden (aanvullende figuur 1d).Het suggereert eerder dat ze in dit systeem fasescheiding bevorderen door macromoleculaire crowding-effecten, aangezien PEG een bij voorkeur stabiel crowding-middel is, zoals te zien is in andere LLP-systemen .Deze eiwitrijke druppeltjes waren gevoelig voor NaCl (1 M) maar niet voor 1,6-HD (10% v / v), wat hun elektrostatische eigenschappen bevestigde (aanvullende figuur 2a, b).Hun vloeistofgedrag werd bevestigd door het observeren van samensmeltende druppelgebeurtenissen in milliseconden met behulp van BF-microscopie (Fig. 2b).
een confocale (CF) microscopiebeelden van αS / Tau441-coacervaten in LLPS-buffer (10 μM van elk eiwit, 0, 5 μM AF488-gelabeld αS en Atto647N-gelabeld Tau441).b Representatieve differentiële interferentiecontrast (DIC) -beelden van αS / Tau441-druppelfusiegebeurtenissen (10 μM voor elk eiwit).c Fasediagram gebaseerd op lichtverstrooiing (bij 350 nm) van Tau441 LLPS (0–15 µM) in de afwezigheid (links) of aanwezigheid (rechts) van 50 µM αS.Warmere kleuren duiden op meer verstrooiing.d Lichtverstrooiing van αS/Tau441 LLPS-monsters met toenemende αS-concentratie (Tau441 bij 5 µM, N = 2-3 monsterherhalingen zoals aangegeven).e Schematische weergave van enkele tau-eiwitvarianten en verschillende regio's van het eiwit dat in dit onderzoek is gebruikt: negatief geladen N-terminale domein (rood), prolinerijke regio (blauw), microtubuli-bindend domein (MTBD, oranje gemarkeerd), en amyloïdvormende paarspiraal.filamentgebieden (PHF) gelegen binnen de MTBD (grijs).De Net Charge Per Residue (NCPR)-kaart van Tau441 wordt weergegeven.f Met behulp van 1 µM AF488-gelabeld αS en Atto647N-gelabeld ΔNt-, met behulp van 1 µM AF488-gelabeld αS of ΔCt-αS in aanwezigheid van ΔNt-Tau (boven, 10 µM per eiwit) of K18 (onder, 50 µM per eiwit ) ) ) microfoto's van WF gecondenseerd in LLPS- of K18-buffer.De schaalbalken in één afbeelding vertegenwoordigen de schaal van alle afbeeldingen in één paneel (20 µm voor panelen a, b en f).Ruwe gegevens voor panelen c en d worden geleverd als onbewerkte gegevensbestanden.
Om de rol van αS in dit LLPS-proces te testen, hebben we eerst het effect van αS op de druppelstabiliteit onderzocht door middel van nefelometrie met behulp van toenemende concentraties NaCl (figuur 2c).Hoe hoger de zoutconcentratie in de monsters die αS bevatten, hoe hoger de lichtverstrooiingswaarden (bij 350 nm), wat de stabiliserende rol van αS in dit LLPS-systeem aangeeft.Een soortgelijk effect kan worden waargenomen door de αS-concentratie (en dus de αS:Tau441-verhouding) te verhogen tot ca.10-voudige toename ten opzichte van de tau-concentratie (5 µM) (Fig. 2d).Om aan te tonen dat αS een steigereiwit is in coacervaten, hebben we besloten het gedrag van de LLPS-verstoorde Tau-mutant te onderzoeken, die een negatief geladen N-terminaal gebied mist (residuen 1-150, zie Fig. 2e) genaamd ΔNt-Tau.WF-microscopie en nefelometrie bevestigden dat ΔNt-Tau zelf geen LLPS onderging (figuur 2f en aanvullende figuur 2d), zoals eerder gerapporteerd. Toen αS echter werd toegevoegd aan dispersieoplossingen van deze afgeknotte Tau-variant, was het LLPS-proces volledig voltooid. hersteld met druppeldichtheid dichtbij de druppeldichtheid van oplossingen op volledige grootte van Tau en αS onder vergelijkbare omstandigheden en eiwitconcentraties.Dit proces kan ook worden waargenomen onder omstandigheden van lage macromoleculaire crowding (aanvullende figuur 2c).De rol van het C-terminale αS-gebied, maar niet de gehele lengte ervan, in het LLPS-proces werd aangetoond door remming van druppelvorming met behulp van een C-terminale afgeknotte αS-variant zonder residuen 104-140 (Fig. 1a) van de (ΔCt- αS) eiwit (figuur 2f en aanvullende figuur 2d).De colokalisatie van aS en ANt-Tau werd bevestigd door confocale fluorescentiemicroscopie (aanvullende figuur 1b).
Om het LLPS-mechanisme tussen Tau441 en αS verder te testen, werd een extra Tau-variant gebruikt, namelijk het gepaarde spiraalvormige filamentkern (PHF)-fragment in het microtubule-bindende domein (MTBD), dat, als het vier karakteristieke herhaalde domeinen bevat, algemeen ook bekend als als het K18-fragment (zie figuur 2e).Onlangs is gerapporteerd dat aS bij voorkeur bindt aan een tau-eiwit dat zich in een prolinerijk domein bevindt in een sequentie die voorafgaat aan het microtubuli-bindende domein.Het PHF-gebied is echter ook rijk aan positief geladen residuen (zie Figuur 2e), vooral lysine (15% residuen), wat ons ertoe aanzette te testen of dit gebied ook bijdraagt ​​aan de condensatie van het αS/Tau-complex.We hebben waargenomen dat K18 alleen LLPS niet kon activeren bij concentraties tot 100 μM onder de geteste omstandigheden (LLPS-buffer met 15% PEG of 20% dextran) (Figuur 2f).Toen we echter 50 μM αS aan 50 μM K18 toevoegden, werd snelle vorming van eiwitdruppeltjes die K18 en αS bevatten waargenomen door nefelometrie (aanvullende figuur 2d) en WF-microscopie (figuur 2f).Zoals verwacht was ΔCt-αS niet in staat het LLPS-gedrag van K18 te herstellen (figuur 2f).We merken op dat αS/K18-aggregatie iets hogere eiwitconcentraties vereist om LLPS te induceren in vergelijking met αS/ΔNt-Tau of αS/Tau441, als de overige zaken gelijk blijven.Dit komt overeen met een sterkere interactie van het αS C-terminale gebied met het prolinerijke Tau-domein vergeleken met het microtubuli-bindende domein, zoals eerder beschreven 31 .
Gegeven dat ΔNt-Tau geen LLPS kan uitvoeren in de afwezigheid van αS, hebben we deze Tau-variant gekozen als model voor het karakteriseren van αS/Tau LLPS, gezien de eenvoud ervan in LLPS-systemen met Tau van volledige lengte (isotype, Tau441/Tau441).met complexe (heterotypische, αS/Tau441) aggregatieprocessen.We vergeleken de mate van αS-aggregatie (als onderdeel van het gecondenseerde fase-eiwit, fαS,c) in de αS/Tau- en αS/ΔNt-Tau-systemen door centrifugatie en SDS-PAGE-analyse in de gedispergeerde fase (zie 2e), en vonden zeer vergelijkbare waarden voor alle eiwitten in dezelfde concentratie.In het bijzonder verkregen we fαS,c 84 ± 2% en 79 ± 7% voor respectievelijk αS/Tau en αS/ΔNt-Tau, wat suggereert dat de heterotypische interactie tussen αS en tau superieur is aan de interactie tussen tau-moleculen.tussen.
De interactie met verschillende polykationen en het effect van het condensatieproces op de αS-kinetiek werden eerst bestudeerd met behulp van de fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP) -methode.We hebben αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau en αS/pLK coacervaten getest (100 μM αS aangevuld met 2 μM αS AF488-αS en 100 μM Tau441 of ΔNt-Tau of 1 mM pLK).Gegevens werden verkregen binnen de eerste 30 minuten na het mengen van de monstercomponenten.Uit representatieve FRAP-beelden (Fig. 3a, αS / Tau441-condensatie) en hun overeenkomstige tijdsverloopcurven (Fig. 3b, Aanvullende Fig. 3), kan worden gezien dat de αS-kinetiek sterk lijkt op die van Tau441-coacervaten.en ANt-Tau, wat veel sneller is met pLK.De berekende diffusiecoëfficiënten voor αS binnen het coacervaat volgens FRAP (zoals beschreven door Kang et al. 35) zijn D = 0,013 ± 0,009 µm2/s en D = 0,026 ± 0,008 µm2/s voor αS/Tau441 en αS/ΔNt- voor het αS/-systeem.pLK, Tau en D = respectievelijk 0,18 ± 0,04 µm2/s (figuur 3c).De diffusiecoëfficiënt αS in de gedispergeerde fase is echter verschillende ordes van grootte hoger dan die van alle gecondenseerde fasen, zoals bepaald door fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS, zie aanvullende figuur 3) onder dezelfde omstandigheden (LLPS-buffer) maar bij afwezigheid van polykationen. (D = 8 ± 4 µm2/s).Daarom is de kinetiek van αS-translatie aanzienlijk verminderd in coacervaten vergeleken met eiwitten in de gedispergeerde fase als gevolg van uitgesproken moleculaire crowding-effecten, hoewel alle coacervaten vloeistofachtige eigenschappen behouden gedurende het eerste half uur na hun vorming, in tegenstelling tot de tau-fase.snellere kinetiek in pLK-condensaat.
a – c FRAP-analyse van αS-dynamiek (2% AF488-gelabeld αS) in elektrostatische coacervaten.Representatieve afbeeldingen van αS/Tau441 FRAP-testen in drievoud worden weergegeven in (a), waarbij rode cirkels ontkleurde gebieden aangeven.De schaalbalk is 5 µm.b Gemiddelde FRAP-curven en (c) berekende diffusiecoëfficiënten (D) voor 5-6 (N) verschillende druppels uit drie experimenten met 100 µM αS en equimolaire concentraties van Tau441 (rood) of ΔNt-Tau (blauw) of pLK (groen) bij tien maal de concentratie van LLPS.De standaardafwijking van de FRAP-curve wordt gearceerd weergegeven.Ter vergelijking werd de diffusiecoëfficiënt aS in de gedispergeerde fase in drievoud bepaald met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) (zie aanvullende figuur 3 en methoden voor meer informatie).d Continue X-band EPR-spectra van 100 μM TEMPOL-122-αS in LLPS-buffer zonder enige polykation (zwart) of in aanwezigheid van 100 μM Tau441 (rood) of ΔNt-Tau (blauw) of 1 mM pLK (groen).De inzet toont een uitvergroot beeld van de sterke veldlijnen waar de meest dramatische veranderingen plaatsvinden.e Bindingscurven van 50 μM TEMPOL-122-αS met verschillende polykationen in afwezigheid van LLPS (geen PEG).Er is aangetoond dat de verminderde amplitude van band III vergeleken met band II (IIII/III) van het genormaliseerde EPR-spectrum de molaire verhoudingen van Tau441 (rood), ANt-Tau (blauw) en pLK (groen) verhoogt.Gekleurde lijnen tonen de fit met gegevens met behulp van een ruw bindingsmodel met n identieke en onafhankelijke bindingsplaatsen op elke curve.Ruwe gegevens worden aangeleverd in de vorm van ruwe databestanden.
Als aanvulling hebben we de dynamiek van αS in verschillende coacervaten onderzocht met behulp van gerichte spinlabeling (SDSL) en continue elektronenparamagnetische resonantie (CW-EPR).Deze methode is zeer nuttig gebleken bij het rapporteren van de flexibiliteit en dynamiek van de IDP met een realistische resterende resolutie36,37,38.Daartoe hebben we cysteïneresiduen geconstrueerd in enkele Cys-mutanten en de 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) spinprobe gebruikt.Maleimidederivaten labelen ze.Meer specifiek hebben we TEMPOL-sondes ingevoegd op positie 122 of 24 αS (TEMPOL-122-αS en TEMPOL-24-αS).In het eerste geval richten we ons op het C-terminale gebied van het eiwit, dat betrokken is bij de interactie met polykationen.In plaats daarvan kan positie 24 ons informatie geven over de algehele dynamiek van de eiwitten in het condensaat.In beide gevallen kwamen de EPR-signalen verkregen voor eiwitten van de gedispergeerde fase overeen met nitroxideradicalen in de snel bewegende toestand.Na fasescheiding in aanwezigheid van tau of pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 of ΔNt-Tau in een verhouding van 1:1 of pLK in een verhouding van 1:10), werd een toename van de relatieve piekintensiteit waargenomen in het EPR-spectrum van αS.De verlieslijn werd breder, wat wijst op een verminderde αS-heroriëntatiekinetiek in druppeltjes vergeleken met eiwit in de verdunde fase (figuur 3d, aanvullende figuur 4a).Deze veranderingen zijn meer uitgesproken op positie 122. Terwijl op positie 24 de aanwezigheid van pLK de kinetiek van de sonde niet beïnvloedde, veranderde op positie 122 de vorm van de spectraallijn aanzienlijk (aanvullende figuur 4a).Toen we probeerden de spectra op positie 122 van twee αS / polykation-systemen te modelleren met behulp van het isotrope model (aanvullende figuur 5a) dat gewoonlijk wordt gebruikt om de dynamiek van spin-gelabelde IDP te beschrijven, waren we niet in staat de experimentele spectra te reconstrueren..Spectrale simulatie van de positie van 24 spincontrasten (aanvullende figuur 5a).Dit suggereert dat er preferentiële posities zijn in de ruimte van spinconfiguraties van het C-terminale gebied van αS in de aanwezigheid van polykationen.Bij het beschouwen van de fractie van αS in de gecondenseerde fase onder experimentele EPR-omstandigheden (84 ± 2%, 79 ± 7% en 47 ± 4% voor respectievelijk αS/Tau, αS/ΔNt-Tau en αS/pLK, zie aanvullende Fig. 2e van data-analyse c), kan worden gezien dat de door de EPR-methode gedetecteerde verbreding voornamelijk de interactie weerspiegelt van het C-terminale gebied van αS met verschillende polykationen in de gecondenseerde fase (de belangrijkste verandering bij gebruik van TEMPOL-122- αS), en niet eiwitcondensatie.In de sonde wordt een toename van de microviscositeit waargenomen.Zoals verwacht werd het EPR-spectrum van het eiwit onder andere omstandigheden dan LLPS volledig hersteld toen 1 M NaCl aan het mengsel werd toegevoegd (aanvullende figuur 4b).Over het geheel genomen suggereren onze gegevens dat de door CW-EPR gedetecteerde veranderingen voornamelijk de interactie weerspiegelen van het C-terminale gebied van αS met verschillende polykationen in de gecondenseerde fase, en deze interactie lijkt sterker te zijn met pLK dan met Tau.
Om meer structurele informatie te verkrijgen over de eiwitten in het coacervaat, hebben we besloten het LLPS-systeem te bestuderen met behulp van NMR in oplossing.We konden echter alleen de αS-fractie detecteren die in de gedispergeerde fase achterbleef, wat mogelijk te wijten is aan de verminderde eiwitdynamiek in het coacervaat en een dichte fase op de bodem van de oplossing in NMR-analyse.Toen we de structuur en dynamiek analyseerden van het eiwit dat in de gedispergeerde fase van het LLPS-monster achterbleef met behulp van NMR (aanvullende figuur 5c, d), merkten we dat het eiwit zich vrijwel identiek gedroeg in de aanwezigheid van pLK en ΔNt-Tau, beide die zich in de secundaire structuur en dynamiek van de eiwithoofdketen bevonden, onthuld door experimenten met secundaire chemische verschuiving en R1ρ-relaxatie.NMR-gegevens laten zien dat het C-uiteinde van αS een aanzienlijk verlies aan conformationele flexibiliteit lijdt, terwijl het zijn ongeordende aard behoudt, net als de rest van de eiwitsequentie, als gevolg van de interacties met polykationen.
Omdat de verbreding van het CW-EPR-signaal waargenomen in de gecondenseerde fase van TEMPOL-122-αS de interactie van het eiwit met polykationen weerspiegelt, hebben we een EPR-titratie uitgevoerd om de bindingsaffiniteit van αS voor verschillende polykationen te evalueren in afwezigheid van LLPS (geen accumulatie van Buffer LLPS), wat suggereert dat de interacties hetzelfde zijn in verdunde en geconcentreerde fasen (wat wordt bevestigd door onze gegevens, aanvullende figuur 4a en aanvullende figuur 6).Het doel was om te zien of alle coacervaten, ondanks hun gemeenschappelijke vloeistofachtige eigenschappen, enig onderliggend differentieel gedrag op moleculair niveau vertonen.Zoals verwacht werd het EPR-spectrum breder met toenemende polykationconcentratie, wat een afname van de moleculaire flexibiliteit weerspiegelt als gevolg van moleculaire interacties van alle interactiepartners bijna tot verzadiging (figuur 3e, aanvullende figuur 6).pLK bereikte deze verzadiging bij een lagere molaire verhouding (polykation:αS) vergeleken met ANt-Tau en Tau441.Vergelijking van de gegevens met een benaderend bindingsmodel, uitgaande van n identieke en onafhankelijke bindingsplaatsen, toonde zelfs aan dat de schijnbare dissociatieconstante van pLK (~5 μM) een orde van grootte lager is dan die van Tau441 of ΔNt-Tau (~50 μM). ).µM).Hoewel dit een ruwe schatting is, suggereert dit dat αS een hogere affiniteit heeft voor eenvoudigere polykationen met continue positieve ladingsgebieden.Gegeven dit verschil in affiniteit tussen αS en verschillende polykationen, veronderstelden we dat hun vloeibare eigenschappen in de loop van de tijd anders kunnen veranderen en dus kunnen lijden onder verschillende LSPT-processen.
Gezien de zeer drukke omgeving binnen het eiwitcoacervaat en de amyloïde aard van het eiwit, hebben we het gedrag van het coacervaat in de loop van de tijd geobserveerd om mogelijke LSPT-processen te detecteren.Met behulp van BF- en CF-microscopie (Figuur 4) hebben we waargenomen dat αS / Tau441 voor een groot deel in oplossing coacerveert, waardoor grote druppels worden gevormd die in contact komen met het oppervlak op de bodem van de put / glijbaan en deze bevochtigen als volledige druppels, zoals verwacht (aanvullende figuur 4). ,7d);we noemen deze bodemvormige structuren ‘eiwitvlotten’.Deze structuren bleven vloeibaar omdat ze het vermogen behielden om te fuseren (aanvullende figuur 7b) en konden enkele uren worden gezien nadat LLPS was geactiveerd (figuur 4 en aanvullende figuur 7c).We hebben waargenomen dat het bevochtigingsproces de voorkeur geniet op het oppervlak van hydrofiele in plaats van hydrofobe materialen (aanvullende figuur 7a), zoals verwacht voor elektrostatische coacervaten met ongebalanceerde ladingen en dus hoge elektrostatische oppervlaktepotentialen.Met name waren de coalescentie en rafting van aS/ANT-Tau aanzienlijk verminderd, terwijl de condensaten van aS/pLK aanzienlijk waren verminderd (Fig. 4).Tijdens de korte incubatietijd konden de aS/pLK-druppeltjes samenvloeien en het hydrofiele oppervlak bevochtigen, maar dit proces stopte snel en na 5 uur incubatie werden slechts beperkte coalescentiegebeurtenissen en geen bevochtiging waargenomen.– gel-drip-overgang.
Representatieve BF (grijswaardenpanelen) en CF (rechterpanelen, AF488-gelabeld αS in groen) van coacervaatmonsters die 100 μM αS (1% fluorescerend label) bevatten in LLPS-buffer in aanwezigheid van 100 μM Tau441 (bovenste) fluorescentie) microscopische beelden ΔNt -Tau (midden) of 1 mM pLK (onder) bij verschillende incubatietijden en brandpuntshoogten (z, afstand vanaf de onderkant van de plaatput).De experimenten werden onafhankelijk van elkaar 4-6 keer herhaald met dezelfde resultaten.αS/Tau441-coacervaten worden na 24 uur bevochtigd, waardoor vlotten worden gevormd die groter zijn dan de afbeelding.De schaalbalk voor alle afbeeldingen is 20 µm.
Vervolgens vroegen we ons af of de grote vloeistofachtige eiwitpools gevormd in αS/Tau441 LLPS zouden leiden tot amyloïde aggregatie van een van de onderzochte eiwitten.We volgden de rijping van αS / Tau441-druppeltjes in de loop van de tijd met WF-microscopie onder dezelfde omstandigheden als hierboven, maar met behulp van 1 μM AF488-gelabeld αS en Atto647N-gelabeld Tau441 (Fig. 5a).Zoals verwacht observeerden we volledige eiwitlokalisatie gedurende het rijpingsproces.Interessant is dat vanaf ca.Na 5 uur werden intensere niet-cirkelvormige structuren waargenomen in de vlotten, die we “punten” noemden, waarvan sommige gecolokaliseerd waren met αS, en sommige verrijkt waren met Tau441 (Fig. 5a, witte pijlen).Deze vlekken zijn altijd in grotere mate waargenomen in vlotten voor αS/ΔNt-Tau dan voor αS/ΔNt-Tau.Er waren geen duidelijke vlekken in de druppels van pLK- en Tau-systemen die incompetent waren voor fusie/bevochtiging.Om te testen of deze vlekken die αS en Tau441 bevatten amyloïde-achtige aggregaten zijn, hebben we een soortgelijk experiment uitgevoerd met behulp van CF-microscopie waarbij Tau441 werd gelabeld met Atto647N en vanaf het begin 12,5 μM amyloïde-specifiek thioflavine-T (ThT) werd toegevoegd.kleurstof.Hoewel ThT-kleuring van aS / Tau441-druppeltjes of -vlotten niet werd waargenomen, zelfs niet na 24 uur incubatie (Fig. 5b, bovenste rij - resterende druppels boven eiwitvlotten), waren ThT-positieve structuren die Atto647N-Tau441 bevatten in de vlotten erg zwak.dit repliceert de grootte, vorm en locatie van de eerder beschreven vlekken (Fig. 5b, middelste en onderste rijen), wat suggereert dat de vlekken kunnen overeenkomen met amyloïde-achtige aggregaten gevormd in verouderingsvloeistofcoacervaten.
WF 25 μM αS bij verschillende incubatietijden en brandpuntshoogten (z, afstand vanaf ongebonden bodem) in aanwezigheid van 25 μM Tau441 (1 μM AF488-gelabeld αS en Atto647N-gelabeld Tau441) in een putje van een microscoopplaat met LLPS-buffer) .Zes experimenten werden onafhankelijk herhaald met vergelijkbare resultaten.b CF-microscopisch beeld van 25 μM αS in aanwezigheid van 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-gelabeld Tau441) en 12,5 μM thioflavine-T (ThT).Gewogen eiwitdruppeltjes en afgezette eiwitvlotten en -vlekken worden respectievelijk in de bovenste en middelste rij weergegeven.De onderste rij toont afbeeldingen van vlotten en druppels van 3 onafhankelijke replica's.Witte pijlen geven ThT-positieve stippen in beide panelen aan.De schaalbalk voor alle afbeeldingen is 20 µm.
Om de veranderingen in het coacervaateiwitnetwerk tijdens de overgang van vloeistof naar vast meer gedetailleerd te onderzoeken, hebben we fluorescentie-levensduurbeeldvorming (FLIM) en Förster-resonantie-energieoverdrachtsmicroscopie (FRET) gebruikt (Figuur 6 en aanvullende figuren 8 en 9).Onze hypothese was dat de coacervaatrijping van de laag tot een meer gecondenseerde of zelfs vastachtige geaggregeerde eiwitstructuur leidt tot nauwer contact tussen het eiwit en de fluorescerende probe die eraan vastzit, wat mogelijk een uitdovend effect veroorzaakt dat tot uiting komt in een kortere levensduur van de probe (τ). , zoals eerder beschreven40.,41 ,42.Bovendien kan deze afname in τ voor dubbel gelabelde monsters (AF488 en Atto647N als respectievelijk FRET-donor- en acceptorkleurstoffen) ook gepaard gaan met coacervaatcondensatie en een toename in FRET(E)-efficiëntie tijdens LSPT.We volgden de vorming van vlotten en vlekken in de loop van de tijd in LLPS αS/Tau441- en αS/ΔNt-Tau-monsters (25 µM van elk eiwit in LLPS-buffer die 1 µM AF488-gelabeld αS en/of Atto647N-gelabeld Tau441 of ΔNt-Tau bevat).We hebben een algemene trend waargenomen in die zin dat de fluorescentielevensduur van de AF488 (τ488) en Atto647N (τ647N) probes enigszins afnam naarmate de coacervaten volwassen werden (Fig. 6 en Aanvullende Fig. 8c).Interessant genoeg was deze verandering aanzienlijk verbeterd voor stippen in vlotten (figuur 6c), wat aangeeft dat verdere eiwitcondensatie optrad bij stippen.Ter ondersteuning hiervan werd geen significante verandering in de levensduur van de fluorescentie waargenomen voor αS / ΔNt-Tau-druppeltjes die 24 uur oud waren (aanvullende figuur 8d), wat suggereert dat druppelgelering een proces is dat verschilt van spotten en dat niet gepaard gaat met significante moleculaire reorganisatie. binnen coacervaten.Opgemerkt moet worden dat de stippen verschillende afmetingen en variabele inhoud hebben in αS, vooral voor het αS / Tau441-systeem (aanvullende figuur 8e).De afname van de levensduur van de spotfluorescentie ging gepaard met een toename van de intensiteit, vooral voor Atto647N-gelabeld Tau441 (aanvullende figuur 8a), en hogere FRET-efficiënties voor zowel αS / Tau441- als αS / ΔNt-Tau-systemen, wat duidt op verdere condensatie in LLPS Vijf uur na het triggeren condenseerden de eiwitten in de statische elektriciteit.Vergeleken met αS/ΔNt-Tau hebben we lagere τ647N- en iets hogere τ488-waarden waargenomen in αS/Tau441-spots, vergezeld van lagere en meer inhomogene FRET-waarden.Mogelijk kan dit verband houden met het feit dat in het αS / Tau441-systeem de waargenomen en verwachte αS-overvloed in aggregaten heterogener is, vaak substoichiometrisch vergeleken met Tau, aangezien Tau441 zelf ook LLPS en aggregatie kan ondergaan (aanvullende figuur 8e) .De mate van coalescentie van druppels, vorming van vlotjes en, belangrijker nog, eiwitaggregatie binnen vloeistofachtige coacervaten is echter maximaal wanneer zowel Tau441 als αS aanwezig zijn.
een levenslange fluorescentiemicroscopie (FLIM) beelden van αS/Tau441 en αS/ΔNt-Tau bij 25 μM van elk eiwit (1 μM AF488-gelabeld αS en 1 μM Atto647N-gelabeld Tau441 of ΔNt-Tau) in LLPS-buffer.De kolommen tonen representatieve afbeeldingen van LLPS-monsters op verschillende rijpingstijden (30 min, 5 uur en 24 uur).Het rode kader toont het gebied met αS/Tau441-vlekken.Levensduur wordt weergegeven als kleurenbalken.Schaalbalk = 20 µm voor alle afbeeldingen.b Ingezoomde FLIM-afbeelding van het geselecteerde gebied, weergegeven in het rode vak in paneel a.Levensbereiken worden weergegeven met dezelfde kleurenschaal als in paneel a.Schaalbalk = 5 µm.c Histogrammen die AF488 (gehecht aan αS) of Atto647N (gehecht aan Tau) tonen voor verschillende eiwitsoorten (druppeltjes-D-, vlot-R- en spikkel-P) geïdentificeerd in FLIM-beelden opgenomen voor αS-) timingverdelingen levensduur van Tau441 en αS/ΔNt-Tau-coacervaatmonsters (N = 17-32 ROI voor D, 29-44 ROI voor R en 21-51 ROI voor punten).Gemiddelde en mediaanwaarden worden respectievelijk weergegeven als gele vierkanten en zwarte lijnen in vakken.De onder- en bovengrenzen van het vak vertegenwoordigen respectievelijk het eerste en het derde kwartiel, en de minimum- en maximumwaarden binnen het 1,5-voudige interkwartielbereik (IQR) worden weergegeven als snorharen.Uitschieters worden weergegeven als zwarte diamanten.De statistische significantie tussen paren verdelingen werd bepaald met behulp van een t-test met twee steekproeven, waarbij werd uitgegaan van ongelijke varianties.Tweezijdige t-test p-waarden worden weergegeven met asterisken voor elk paar vergeleken gegevens (* p-waarde > 0,01, ** p-waarde > 0,001, *** p-waarde > 0,0001, **** p-waarde > 0,00001), ns Geeft verwaarloosbaarheid aan (p-waarde > 0,05).De exacte p-waarden worden gegeven in aanvullende tabel 1 en de originele gegevens worden gepresenteerd als onbewerkte gegevensbestanden.
Om de amyloïde-achtige aard van spikkels/aggregaten verder aan te tonen, behandelden we ongekleurde coacervaatmonsters gedurende 24 uur met hoge concentraties (1 M) NaCl, wat resulteerde in de scheiding van aggregaten van eiwitcoacervaten.Toen geïsoleerde aggregaten (dwz een gedispergeerde oplossing van aggregaten) werden waargenomen met behulp van atomaire krachtmicroscopie (AFM), observeerden we een overwegend bolvormige morfologie met een regelmatige hoogte van ongeveer 15 nm, die de neiging heeft te associëren onder omstandigheden van hoge zoutconcentratie, vergelijkbaar met het gedrag van typische amyloïde fibrillen als gevolg van het sterke hydrofobe effect op het oppervlak (merk op dat fibrillen doorgaans een hoogte van ~10 nm hebben) (aanvullende figuur 10a).Interessant genoeg hebben we, toen geïsoleerde aggregaten werden geïncubeerd met ThT in een standaard ThT-fluorescentietest, een dramatische toename in de ThT-fluorescentie-kwantumopbrengst waargenomen, vergelijkbaar met die waargenomen toen de kleurstof werd geïncubeerd met typische αS-amyloïdefibrillen (aanvullende figuur 10b), wat suggereert dat de coacervaataggregaten bevatten amyloïdeachtige structuren..In feite waren de aggregaten tolerant voor hoge zoutconcentraties, maar gevoelig voor 4 M guanidinechloride (GdnHCl), zoals typische amyloïde fibrillen (aanvullende figuur 10c).
Vervolgens analyseerden we de samenstelling van de aggregaten met behulp van fluorescentie van één molecuul, specifieke fluorescentiecorrelatie/kruiscorrelatiespectroscopie (FCS/FCCS) en burst-analyse van tweekleurige coïncidentiedetectie (TCCD).Daartoe isoleerden we aggregaten gevormd na 24 uur incubatie in 100 μl LLPS-monsters die αS en Tau441 bevatten (beide 25 μM) samen met 1 μM AF488-gelabeld αS en 1 μM Atto647N-gelabeld Tau441.Verdun de resulterende gedispergeerde aggregaatoplossing tot een monomoleculaire toestand met behulp van dezelfde PEG-vrije buffer en 1 M NaCl (dezelfde buffer die wordt gebruikt om aggregaten van coacervaat te scheiden) om mogelijke elektrostatische interacties tussen LLPS en eiwit te voorkomen.Een voorbeeld van het tijdstraject van een enkel molecuul is te zien in figuur 7a.FCCS/FCS-analyse (kruiscorrelatie, CC en autocorrelatie, AC) toonde aan dat aggregaten die αS en tau bevatten overvloedig aanwezig waren in de monsters (zie CC-curve in figuur 7b, linkerpaneel), en een overmaat aan resterend monomeer eiwit ontstond als een resultaat van het verdunningsproces (zie AC-curven in figuur 7b, linkerpaneel).Controle-experimenten uitgevoerd onder dezelfde oplossingsomstandigheden met behulp van monsters die alleen monomere eiwitten bevatten, vertoonden geen CC-curven, en de AC-curven passen goed bij het één-component diffusiemodel (vergelijking 4), waarbij monomere eiwitten de verwachte diffusiecoëfficiënten hebben (figuur 7b). ), rechterpaneel).De diffusiecoëfficiënt van geaggregeerde deeltjes is minder dan 1 µm2/s, en die van monomere eiwitten is ongeveer 1 µm2/s.50–100 µm/s;waarden zijn vergelijkbaar met eerder gepubliceerde waarden voor gesoniceerde αS-amyloïdefibrillen en monomere αS afzonderlijk onder vergelijkbare oplossingsomstandigheden44.Toen we de aggregaten analyseerden met TCCD-explosieanalyse (Fig. 7c, bovenste paneel), ontdekten we dat in elk geïsoleerd aggregaat (αS / Tau-heteroaggregaat) ongeveer 60% van de gedetecteerde aggregaten zowel αS als tau bevatte, en dat ongeveer 30% alleen αS en tau bevatte. tau, slechts ongeveer 10% αS.Stoichiometrische analyse van αS/Tau-heteroaggregaten toonde aan dat de meeste heteroaggregaten verrijkt waren met tau (stoichiometrie lager dan 0,5, het gemiddelde aantal tau-moleculen per aggregaat is 4 keer meer dan αS-moleculen), wat consistent is met ons werk waargenomen in FLIM in situ experimenten..FRET-analyse toonde aan dat deze aggregaten beide eiwitten bevatten, hoewel de werkelijke FRET-waarden in dit geval niet van groot belang zijn, aangezien de verdeling van fluoroforen in elk aggregaat willekeurig was vanwege een overmaat aan ongelabeld eiwit dat in het experiment werd gebruikt.Interessant is dat toen we dezelfde analyse uitvoerden met behulp van de 45,46 volwassen amyloïde aggregatie-deficiënte Tau-variant (zie aanvullende figuur 11a, b), we merkten dat, hoewel de αS-elektrostatische aggregatie hetzelfde was (aanvullende figuur 11c, d), het vermogen om aggregaten binnen het coacervaat te vormen werd drastisch verminderd en FLIM detecteerde verschillende plekken in in situ experimenten, en er werden zwakke kruiscorrelatiecurven waargenomen voor geïsoleerde aggregaatmonsters.Voor een klein aantal gedetecteerde aggregaten (slechts een tiende van Tau441) hebben we echter waargenomen dat elk aggregaat verrijkt was in αS dan deze Tau-variant, waarbij ongeveer 50% van de gedetecteerde aggregaten alleen αS-moleculen bevatte, en αS in overmaat heterogeen was. .aggregaten (zie aanvullende figuur 11e), in tegenstelling tot de heterogene aggregaten gegenereerd door Tau441 (figuur 6f).De resultaten van deze experimenten toonden aan dat, hoewel αS zelf in staat is om zich met tau in het coacervaat te accumuleren, de tau-kiemvorming onder deze omstandigheden gunstiger is, en dat de resulterende amyloïde-achtige aggregaten kunnen werken als een vorm van αS en tau.Zodra echter een tau-rijke kern is gevormd, krijgen heterotypische interacties tussen αS en tau in aggregaten de voorkeur boven homotypische interacties tussen tau-moleculen;we observeren ook eiwitnetwerken in vloeibare αS/tau-coacervaten.
een representatieve fluorescentie-temporele sporen van afzonderlijke moleculen van geïsoleerde aggregaten gevormd in αS / Tau441 elektrostatische coacervaten.Bursts overeenkomend met αS/Tau441-coaggregaten (bursts boven de aangegeven drempel) werden waargenomen in drie detectiekanalen (AF488- en Atto647N-emissie na directe excitatie, blauwe en rode lijnen, Atto647N-emissie na indirecte excitatie), FRET, violette lijn).b FCS/FCCS-analyse van een monster van geïsoleerde αS/Tau441-aggregaten verkregen van LLPS (linkerpaneel).Autocorrelatiecurven (AC) voor AF488 en Atto647N worden respectievelijk in blauw en rood weergegeven, en kruiscorrelatiecurven (CC) geassocieerd met aggregaten die beide kleurstoffen bevatten, worden in paars weergegeven.De AC-curven weerspiegelen de aanwezigheid van gelabelde monomere en geaggregeerde eiwitsoorten, terwijl de CC-curven alleen de diffusie van dubbelgelabelde aggregaten laten zien.Dezelfde analyse, maar onder dezelfde oplossingsomstandigheden als op geïsoleerde plekken, monsters die alleen monomeer αS en Tau441 bevatten, worden als controles in het rechterpaneel weergegeven.c Fluorescentie-flitsanalyse van afzonderlijke moleculen van geïsoleerde aggregaten gevormd in αS/Tau441 elektrostatische coacervaten.Informatie voor elk aggregaat gevonden in vier verschillende herhalingen (N = 152) wordt uitgezet tegen hun stoichiometrie, S-waarden en FRET-efficiëntie (bovenste paneel, kleurenbalk weerspiegelt het voorkomen).Er kunnen drie typen aggregaten worden onderscheiden: -αS-only aggregaten met S~1 en FRET~0, Tau-only aggregaten met S~0 en FRET~1, en heterogene Tau/αS-aggregaten met tussenliggende S en FRET. Schattingen van de hoeveelheid van beide markereiwitten gedetecteerd in elk heterogeen aggregaat (N = 100) worden weergegeven in het onderste paneel (de kleurenschaal weerspiegelt het voorkomen).Ruwe gegevens worden aangeleverd in de vorm van ruwe databestanden.
Er is gerapporteerd dat de rijping of veroudering van vloeibare eiwitcondensaten in de loop van de tijd tot gelachtige of vaste structuren betrokken is bij verschillende fysiologische functies van het condensaat47 en bij ziekten, als een abnormaal proces dat voorafgaat aan de aggregatie van amyloïden 7, 48, 49. Hier we bestuderen fasescheiding en gedrag in detail.LSPT αS in de aanwezigheid van willekeurige polykationen in een gecontroleerde omgeving bij lage micromolaire concentraties en fysiologisch relevante omstandigheden (merk op dat de berekende fysiologische concentratie van αS> 1 µM50 is), volgens typisch thermodynamisch gestuurd gedrag van LPS.We ontdekten dat αS, dat een sterk negatief geladen C-terminaal gebied bij een fysiologische pH bevat, in staat is eiwitrijke druppeltjes te vormen in een waterige oplossing via LLPS in de aanwezigheid van zeer kationische ongeordende peptiden zoals pLK of Tau door het proces van elektrostatische ontlading. complexe condensatie in aanwezigheid van aggregatiemacromoleculen.Dit proces kan relevante effecten hebben in de cellulaire omgeving waar αS verschillende polykationische moleculen tegenkomt die geassocieerd zijn met de ziekte-geassocieerde aggregatie ervan, zowel in vitro als in vivo .
In veel onderzoeken wordt de eiwitdynamiek in druppeltjes beschouwd als een van de sleutelfactoren die het rijpingsproces bepalen55,56.In elektrostatische αS-coacervaten met polykationen hangt het rijpingsproces blijkbaar af van de sterkte van de interacties met polykationen, de valentie en de veelheid van deze interacties.De evenwichtstheorie suggereert dat een evenwichtslandschap van twee vloeibare toestanden de aanwezigheid zou zijn van een grote druppel rijk aan biopolymeren die LLPS aanstuurt57,58.Druppelgroei kan worden bereikt door Ostwald-rijping59, coalescentie60 of consumptie van vrij monomeer in de gedispergeerde fase61.Voor aS en Tau441, ANt-Tau of pLK werd het grootste deel van het eiwit geconcentreerd in het condensaat onder de omstandigheden die in dit onderzoek werden gebruikt.Hoewel tau-druppeltjes van volledige grootte snel samenvloeiden bij oppervlaktebevochtiging, waren druppelcoalescentie en bevochtiging moeilijk voor ANt-Tau en pLK, wat duidt op een snel verlies van vloeistofeigenschappen in deze twee systemen.Volgens onze FLIM-FRET-analyse vertoonden de verouderde pLK- en ΔNt-Tau-druppeltjes een vergelijkbare mate van eiwitaggregatie (vergelijkbare fluorescentielevensduur) als de oorspronkelijke druppeltjes, wat suggereert dat het oorspronkelijke eiwitnetwerk behouden bleef, zij het stijver.
We rationaliseren onze experimentele resultaten in het volgende model (Figuur 8).De aanvankelijk tijdelijk gevormde druppeltjes zijn vaak eiwitnetwerken zonder elektrostatische compensatie, en er zijn dus gebieden waar de lading onevenwichtig is, vooral aan het druppelgrensvlak, wat resulteert in druppeltjes met een hoog elektrostatisch oppervlaktepotentieel.Om de lading te compenseren (een fenomeen dat gewoonlijk valentie-uitputting wordt genoemd) en het oppervlaktepotentieel van de druppeltjes te minimaliseren, kunnen de druppeltjes nieuwe polypeptiden uit de verdunde fase bevatten, eiwitnetwerken reorganiseren om de lading-lading-interacties te optimaliseren, en een interactie aangaan met andere druppeltjes.met oppervlakken (bevochtiging).De αS/pLK-druppeltjes lijken, vanwege hun eenvoudiger eiwitnetwerk (alleen heterotypische interacties tussen αS en pLK) en grotere affiniteit voor eiwit-eiwit-interacties, de lading van het condensaat sneller in evenwicht te kunnen brengen;we hebben inderdaad een snellere eiwitkinetiek waargenomen in aanvankelijk gevormde αS/pLK-coacervaten dan in αS/Tau.Na uitputting van de valentie worden de interacties minder kortstondig en verliezen de druppeltjes hun vloeibare eigenschappen en veranderen ze in gelachtige, niet-ontvlambare druppeltjes met een laag elektrostatisch oppervlaktepotentieel (en daarom niet in staat het oppervlak te bevochtigen).Daarentegen zijn αS/Tau-druppeltjes minder efficiënt in het optimaliseren van de ladingsbalans van de druppeltjes vanwege complexere eiwitnetwerken (met zowel homotypische als heterotypische interacties) en de zwakkere aard van eiwitinteracties.Dit resulteert in druppeltjes die gedurende langere tijd hun vloeistofgedrag behouden en een hoog elektrostatisch oppervlaktepotentieel vertonen dat de neiging heeft te worden geminimaliseerd door coalesceren en groeien (waardoor de oppervlakte/volumeverhouding van de druppeltjes wordt geminimaliseerd) en door het hydrofiele oppervlak te bevochtigen.Hierdoor ontstaan ​​grote geconcentreerde eiwitbibliotheken die vloeibare eigenschappen behouden, aangezien de interacties zeer tijdelijk blijven als gevolg van de constante zoektocht naar ladingsoptimalisatie in het eiwitnetwerk.Interessant is dat N-terminaal afgeknotte vormen van Tau, waaronder enkele natuurlijk voorkomende isovormen62, intermediair gedrag vertonen, waarbij sommige coacervaten met αS verouderen tot langlevende gelachtige druppeltjes, terwijl andere transformeren in grote vloeibare condensaten.Deze dualiteit in de rijping van αS-elektrostatische coacervaten komt overeen met recente theoretische en experimentele LLPS-studies die een correlatie tussen valentie-uitputting en elektrostatisch zeven in condensaten hebben geïdentificeerd als een sleutel tot het beheersen van de condensaatgrootte en vloeistofeigenschappen.Mechanisme 58.61.
Dit schema toont de vermeende amyloïde-aggregatieroute voor αS en Tau441 via LLPS en LSPT.Met extra anionrijke (rode) en kationrijke (blauwe) gebieden hebben αS- en tau-elektrostatische coacervaten met bevredigende valentie een lagere oppervlakte-energie en daarom minder coalescentie, wat resulteert in snelle veroudering van de druppels.Er wordt een stabiele, niet-geagglomereerde geltoestand bereikt..Deze situatie is zeer gunstig in het geval van het αS/pLK-systeem vanwege de hogere affiniteit en het eenvoudigere eiwit-paar-interactienetwerk, dat een snelle gelachtige overgang mogelijk maakt.Integendeel, druppeltjes met een onbevredigende valentie en daarom met eiwitgeladen gebieden die beschikbaar zijn voor interactie, maken het voor het coacervaat gemakkelijker om te fuseren en het hydrofiele oppervlak te bevochtigen om de hoge oppervlakte-energie ervan te verminderen.Deze situatie verdient de voorkeur voor αS/Tau441-coacervaten, die een multivalent complex netwerk hebben dat bestaat uit zwakke Tau-Tau- en αS-Tau-interacties.Op hun beurt zullen grotere coacervaten gemakkelijker hun vloeistofachtige eigenschappen behouden, waardoor andere eiwit-tot-eiwit-interacties kunnen optreden.Uiteindelijk vormen zich amyloïde heterogene aggregaten die zowel αS als tau bevatten in de coacervaatvloeistof, wat verband kan houden met die gevonden in inclusielichaampjes, die kenmerken zijn van neurodegeneratieve ziekten.
De grote vloeistofachtige structuren gevormd tijdens de rijping van αS/Tau441 met een zeer drukke maar dynamische eiwitomgeving en, in mindere mate, αS/ΔNt-Tau-coacervaten zijn ideale reservoirs voor de nucleatie van eiwitaggregatie.We hebben inderdaad de vorming van vaste eiwitaggregaten waargenomen in dit soort eiwitcoacervaten, die vaak zowel αS als tau bevatten.We hebben aangetoond dat deze heteroaggregaten worden gestabiliseerd door niet-elektrostatische interacties, in staat zijn amyloïde-specifieke ThT-kleurstoffen op dezelfde manier te binden als typische amyloïde fibrillen, en inderdaad een vergelijkbare weerstand tegen verschillende invloeden hebben.Er werd aangetoond dat de door LLPS gevormde aS/tau-aggregaten amyloïde-achtige eigenschappen hebben.De volwassen variant van Tau met een tekort aan amyloïdeaggregatie wordt inderdaad aanzienlijk aangetast bij de vorming van deze heterogene aS-aggregaten in het vloeibare elektrostatische coacervaat.De vorming van aS/Tau441-aggregaten werd alleen waargenomen binnen de coacervaten, die vloeistofachtige eigenschappen behielden, en nooit, als de coacervaten/druppeltjes de geltoestand niet bereikten.In het laatste geval verhinderen de toegenomen sterkte van elektrostatische interacties en, als gevolg daarvan, de stijfheid van het eiwitnetwerk de noodzakelijke conformationele herschikkingen van eiwitten om nieuwe eiwitinteracties tot stand te brengen die nodig zijn voor amyloïdenucleatie.Dit kan echter worden bereikt in flexibelere, vloeistofachtige coacervaten, die op hun beurt waarschijnlijker vloeibaar blijven naarmate ze groter worden.
Het feit dat de vorming van aggregaten in de gecondenseerde fase de voorkeur heeft in grote αS/Tau-condensaten dan in kleine druppeltjes die snel geleren, benadrukt de relevantie van het identificeren van de factoren die de coalescentie van de druppels controleren.Er is dus niet alleen een tendens tot fasescheiding, maar de grootte van het condensaat moet ook worden gecontroleerd voor een goede werking en voor het voorkomen van ziekten58,61.Onze resultaten benadrukken ook het belang van de balans tussen LLPS en LSPT voor het αS/Tau-systeem.Hoewel druppelvorming bescherming kan bieden tegen amyloïdaggregatie door de hoeveelheid eiwitmonomeren die beschikbaar zijn onder verzadigingsomstandigheden te verminderen, zoals is voorgesteld in andere systemen63,64, kan druppelfusie bij hoge druppelniveaus leiden tot interne eiwitaggregatie door langzame conformationele herschikkingen.eiwit netwerken..
Over het geheel genomen benadrukken onze gegevens sterk de relevantie van samenhangende valentie en tevreden/ontevreden interacties in drop-netwerken in de context van LSPT.In het bijzonder laten we zien dat αS/Tau441-condensaten met de volledige lengte in staat zijn om efficiënt te fuseren en te kiemen om amyloïde-achtige heteroaggregaten te vormen die beide eiwitten omvatten, en stellen een moleculair mechanisme voor op basis van onze experimentele resultaten.De co-aggregatie van twee eiwitten in het αS/Tau-vloeistofcoacervaat dat we hier rapporteren, kan inderdaad verband houden met de co-lokalisatie van twee eiwitten in insluitsels, die kenmerkend zijn voor de ziekte, en kan bijdragen aan het begrijpen van de relatie tussen LLPS en amyloïde aggregatie, wat de weg vrijmaakt voor hooggeladen IDP bij neurodegeneratie.
Monomere WT-αS-, cysteïnemutanten (Q24C-αS, N122C-αS) en ΔCt-αS-varianten (Δ101-140) werden tot expressie gebracht in E. coli en gezuiverd zoals eerder beschreven.5 mM DTT werd opgenomen in alle stappen van de zuivering van aS-cysteïnemutanten om de vorming van disulfidebindingen te voorkomen.Tau441 isovorm (plasmide verkregen van Addgene #16316), ANt-Tau-variant (Δ1-150, verkregen door IVA te klonen met primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) en AggDef-Tau-variant (Δ275-311, gezuiverd met GGCTC5-primer) E. coli-culturen werden gegroeid tot OD600 = 0,6-0,7 bij 37°C en 180 rpm, en expressie werd gedurende 3 uur bij 37°C geïnduceerd met IPTG.Oogst cellen bij 11.500 xg gedurende 15 minuten bij 4 ° C en was met zoutbuffer die 150 mM NaCl bevat.Resuspendeer de pellet in lysisbuffer (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptine 100 μM).De sonicatiestap werd uitgevoerd op ijs met een amplitude van 80% gedurende 10 pulsen (1 min aan, 1 min uit).Overschrijd niet meer dan 60 ml per echografie.E. coli-lysaten werden 20 minuten verwarmd op 95°C, vervolgens afgekoeld op ijs en 40 minuten gecentrifugeerd bij 127.000 x g.Het geklaarde supernatant werd aangebracht op een membraan van 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, VK) en gedialyseerd tegen 4 liter dialysebuffer (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) gedurende 10 uur.Een kationenuitwisselingskolom van 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, VS) werd geëquilibreerd met evenwichtsbuffer (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Het tau-lysaat werd door een PVDF-filter van 0,22 μm gefiltreerd en in de kolom geïnjecteerd met een stroomsnelheid van 1 ml/min.Elutie werd geleidelijk uitgevoerd, tau werd geëlueerd met 15-30% elutiebuffer (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).De fracties werden geanalyseerd met SDS-PAGE, en alle fracties die één band met het verwachte molecuulgewicht van tau bevatten, werden geconcentreerd met behulp van een centrifugefilter van 10 kDa en vervangen door een buffer die 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM en DTT 2 mM bevatte. de uiteindelijke eiwitconcentratie was 100 μM.De eiwitoplossing werd vervolgens door een PVDF-filter van 0,22 μm geleid, snel ingevroren en bij -80°C bewaard.Eiwit K18 werd vriendelijk verstrekt door Prof. Alberto Boffi.De zuiverheid van het preparaat was >95%, zoals bevestigd door SDS-PAGE en MALDI-TOF/TOF.Verschillende cysteïnes werden chemisch gelabeld met AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, VS) of TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).werden bevestigd door absorptie en MALDI-TOF/TOF.Tau441, ANt-Tau, AggDef-Tau en K18 werden gelabeld met natieve cysteïneresiduen op posities 191 en 322 met behulp van Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Duitsland) volgens dezelfde procedure.Netto lading per residukaarten voor αS en Tau441 werden gegenereerd met behulp van CIDER66.
Vast poly-L-lysine (pLK DP 90-110 volgens NMR van leverancier Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, VS) werd opgelost in 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 tot 10 mM concentratie, proces gedurende 5 minuten gesoniceerd. minuten in een ultrasoon waterbad en bewaar bij -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, VS) en FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, VS) zijn in water oplosbaar en wijdverspreid in LLPS-buffer.Dialyse verwijdert verontreinigende zouten.Ze werden vervolgens gefilterd door een spuitfilter met een poriegrootte van 0,22 μm, en hun concentraties werden berekend met behulp van een refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, VS).LLPS-monsters werden in de volgende volgorde bij kamertemperatuur bereid: buffer en extrusie werden gemengd en 1 mM tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP, Carbosynth, Compton, VK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethaan- 1, 2-diyldinitril) tetra-azijnzuur (EDTA, carboxynth) en een mengsel van 1% proteaseremmer (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptine 5 μM).Vervolgens worden aS en gefuseerde polykationen (opties pLK of Tau) toegevoegd.Gebruik voor thioflavine-T-tijdreeksexperimenten (ThT, Carbosynth, Compton, VK) de totale ThT-concentratie als de helft van de αS-concentratie.Meng de monsters voorzichtig maar grondig om er zeker van te zijn dat ze homogeen zijn.De concentratie van elke component varieerde van experiment tot experiment, zoals beschreven in de sectie Resultaten.Azide werd gebruikt in een concentratie van 0,02% (w/v) wanneer de duur van het experiment langer dan 4 uur duurde.Laat voor alle analyses met LLPS-monsters het mengsel vóór de analyse gedurende 5 minuten in evenwicht komen.Voor analyse van lichtverstrooiing werd 150 µl monsters op niet-bindende microplaten met 96 putjes geladen (μClear®, zwart, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Oostenrijk) en bedekt met kleeffolie.LLP's werden gevolgd door het meten van de absorptie bij 350 nm in het midden van de oplossing in een CLARIOstar-plaatlezer (BMG Labtech, Ortenberg, Duitsland).De experimenten werden in drievoud bij 25°C uitgevoerd en de fouten werden berekend als de standaardafwijking van het gemiddelde.De verdunde fase werd gekwantificeerd door monstercentrifugatie en SDS-PAGE-gelanalyse, en de aS-fractie in de verdunde en geconcentreerde fasen werd gekwantificeerd in verschillende LLPS-oplossingen.Een 100 μl LLPS-monster dat 1 μM AF488-gelabeld aS bevatte, werd bereid door grondig mengen gevolgd door 30 minuten centrifugeren bij 9600 x g, waarna het neerslag gewoonlijk zichtbaar was.De bovenste 50 μl van het supernatant werd gebruikt voor eiwitkwantificering met behulp van SDS-PAGE-gel.Gels werden gescand met AF488-filters met behulp van een ChemiDoc-gelbeeldvormingssysteem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, VS) of gekleurd met Coomassie-kleuring en gevisualiseerd met geschikte filters.De resulterende banden werden geanalyseerd met behulp van ImageJ versie 1.53i (National Institutes of Health, VS).De experimenten werden in tweevoud uitgevoerd in twee verschillende experimenten met vergelijkbare resultaten.
Typisch werd 150 μl monsters aangebracht op niet-bindende microplaten met 96 putjes en gevisualiseerd bij kamertemperatuur op een Leica DMI6000B omgekeerde microscoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland).Voor spot-experimenten werden ook µ-Slide Angiogenesis-platen (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Duitsland) of polystyreenmicroplaten met 96 putjes (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) gebruikt.EL6000-halogeen- of kwik-metaalhalogenidelampen werden gebruikt als verlichtingsbronnen (respectievelijk voor BF/DIC- en WF-beeldvorming).Voor WF-microscopie werd een luchtobjectief met een vergroting van 40x (Leica Microsystems, Duitsland) gebruikt om het licht op het monster te richten en dit te verzamelen.Voor AF488- en ThT-gelabelde monsters, filterexcitatie en emissie met standaard GFP-filtersets, excitatie- en emissiebanddoorlaatfilters, respectievelijk 460-500 nm en 512-542 nm banddoorlaatfilters, en een 495 nm dichroïsche spiegel.Voor monsters gelabeld met Atto647N werd een standaardset Cy5-filters met excitatie- en emissiebanddoorlaatfilters van respectievelijk 628-40 nm en 692-40 nm en een dichroïsche spiegel van 660 nm gebruikt.Gebruik voor BF- en DIC-microscopie hetzelfde doel voor het verzamelen van gereflecteerd licht.Het verzamelde licht werd opgenomen op een Leica DFC7000 CCD-camera (Leica Microsystems, Duitsland).De belichtingstijd was 50 ms voor BF- en DIC-microscopiebeelden en 20-100 ms voor WF-microscopiebeelden.Ter vergelijking: de belichtingstijd voor alle experimenten met ThT was 100 ms.Er werden time-lapse-experimenten uitgevoerd om de coalescentie van druppels te visualiseren, waarbij gedurende enkele minuten elke 100 ms beelden werden verzameld.ImageJ (NIH, VS) werd gebruikt voor beeldanalyse.De experimenten werden in drievoud uitgevoerd met vergelijkbare resultaten.
Voor colocalisatie-experimenten, FRAP en 3D-reconstructie werden beelden verkregen op een Zeiss LSM 880 omgekeerde confocale microscoop met behulp van een ZEN 2 blauwe editie (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Duitsland).Monsters van 50 µl werden aangebracht op µ-Slide Angiogenesis petrischalen (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Duitsland), behandeld met een hydrofiel polymeer (ibiTreat) en gemonteerd in een 63x olie-immersieobjectief (Plan-Apochromat 63x/NA 1.4 Oil) op DIC).Beelden werden verkregen met behulp van argonlaserlijnen van 458 nm, 488 nm en 633 nm met een resolutie van 0,26 µm/pixel en een belichtingstijd van 8 µs/pixel voor excitatie- en emissiedetectievensters van 470-600 nm, 493-628 nm, en 638-755 nm werd gebruikt om respectievelijk ThT, AF488 en Atto647N te visualiseren.Voor de FRAP-experimenten werd time-lapse-fotografie van elk monster opgenomen met 1 frame per seconde.De experimenten werden in drievoud bij kamertemperatuur uitgevoerd met vergelijkbare resultaten.Alle afbeeldingen werden geanalyseerd met behulp van Zen 2 blue edition-software (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Duitsland).De FRAP-curven werden genormaliseerd, uitgezet en aangepast aan intensiteit/tijdgegevens geëxtraheerd uit afbeeldingen met behulp van Zen 2 met behulp van OriginPro 9.1.De herstelcurven werden aangepast aan een mono-exponentieel model om rekening te houden met moleculaire diffusie, met een extra exponentiële term om rekening te houden met het acquisitiebleekeffect.Vervolgens berekenden we D met behulp van de nominale bleekradius en de eerder bepaalde herstelhalfwaardetijd zoals in de vergelijking van Kang et al.5 35 afgebeeld.
Enkelvoudige cysteïnevarianten van αS werden gesynthetiseerd met 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) op posities 24 (TEMPOL-24-αS) en 122 (TEMPOL-122-αS), respectievelijk.Spinlabeling Voor EPR-experimenten werd de αS-concentratie ingesteld op 100 μM en de PEG-concentratie 15% (w/v).Voor verschillende aggregatieomstandigheden was de aS:pLK-verhouding 1:10, terwijl de aS:ANT-Tau- en aS:Tau441-verhoudingen op 1:1 werden gehouden.Voor bindingstitratie-experimenten bij afwezigheid van crowding werd TEMPOL-122-αS op 50 μM gehouden en werden polykationen getitreerd bij toenemende concentraties, waarbij elke toestand afzonderlijk werd voorbereid.CW-EPR-metingen werden uitgevoerd met behulp van een Bruker ELEXSYS E580 X-band spectrometer uitgerust met een Bruker ER4118 SPT-N1-resonator die werkte op een microgolffrequentie (SHF) van ~9,7 GHz.De temperatuur werd ingesteld op 25°C en geregeld door een cryostaat met vloeibare stikstof.De spectra werden verkregen onder onverzadigde omstandigheden bij een MW-vermogen van 4 mW, een modulatieamplitude van 0,1 mT en een modulatiefrequentie van 100 kHz.Spectrale intensiteiten werden genormaliseerd om verschillen in spinconcentraties tussen monsters en mogelijke spinreductie als gevolg van resterende concentraties van reductiemiddelen in monsters die Tau441 of ANt-Tau bevatten (aanwezig in de oorspronkelijke eiwitoplossingen) te voorkomen.De gegeven waarden van g werden verkregen als resultaat van EPR-spectrale modellering uitgevoerd met behulp van de Easyspin-software (v. 6.0.0-dev.34) geïmplementeerd in Matlab®67.Er werden isotrope modellen met één of twee componenten gebruikt om de gegevens te modelleren.Na het normaliseren van alle signalen werden de residuen berekend door elke simulatie af te trekken van het overeenkomstige experimentele spectrum.Voor bindingstitratieanalyse werd de relatieve intensiteit van de derde band ten opzichte van de tweede band van het genormaliseerde EPR-spectrum (IIII/III) gebruikt om de binding van polykationen aan aS te volgen.Om de dissociatieconstante (Kd) te schatten, werd de resulterende curve aangepast aan een benaderend model, waarbij werd uitgegaan van n identieke en onafhankelijke bindingsplaatsen.
NMR-spectroscopie-experimenten werden uitgevoerd met behulp van een Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR-spectrometer uitgerust met een cryoprobe en Z-gradiënt.Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van 130–207 µM αS en overeenkomstige αS/ΔNt-Tau en pLK-equivalenten in 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 en werden uitgevoerd bij 15 ° C.Om LPS met NMR te monitoren, werd 10% PEG aan de voorgemengde monsters toegevoegd.De verstoringsgrafiek van de chemische verschuiving (Fig. 1b) toont de gemiddelde chemische verschuivingen van 1H en 15N.De αS 2D1H-15N HSQC-spectra werden toegewezen op basis van een eerdere toewijzing (BMRB-invoer #25227) en bevestigd door het opnemen en analyseren van de 3D-spectra van HNCA, HNCO en CBCAcoNH.13Cα en 13Cβ chemische verschuivingen werden berekend in de aanwezigheid van ANt-Tau of pLK om mogelijke veranderingen in secundaire structuurtrends te meten in vergelijking met αS chemische verschuivingen in pure willekeurige spoelconformatie 68 (aanvullende figuur 5c).De R1ρ-snelheden werden gemeten door het opnemen van hsqctretf3gpsi-experimenten (verkregen van de Bruker-bibliotheek) met vertragingen van 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 en 800 ms, en de exponentiële functies werden aangepast aan de piekintensiteitsvertragingen op verschillende tijdstippen. keer om de R1ρ en de experimentele onzekerheid ervan te bepalen.
Tweekleuren tijdsopgeloste fluorescentiemicroscopie-experimenten werden uitgevoerd op een commerciële tijdsopgeloste MT200 fluorescentie confocale microscoop (PicoQuant, Berlijn, Duitsland) met een tijdsgecorreleerd apparaat voor het tellen van enkele fotonen (TCSPC).De laserdiodekop wordt gebruikt voor gepulseerde interleaved excitatie (PIE), de straal gaat door een single-mode golfgeleider en wordt afgestemd op een laservermogen van 10 tot 100 nW voor 481 nm en 637 nm laserlijnen gemeten na een dichroïsche spiegel.Dit zorgt voor een optimale telsnelheid van fotonen, waarbij de effecten van foton-aliasing, fotobleken en verzadiging worden vermeden.μ-Slide angiogenese dekglaasjes of platen (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Duitsland) werden direct in immersiewater geplaatst over een Super Apochromat 60x NA 1.2 lens met een corrigerende kraag (Olympus Life Sciences, Waltham, VS).Een dichroïsche spiegel van 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, VS) werd gebruikt als de grootlichtsplitser.Ongefocusseerde straling wordt geblokkeerd door een gat met een diameter van 50 micron, waarna de gefocusseerde straling door een 50/50 beamsplitter in 2 detectiepaden wordt verdeeld.Banddoorlaatemissiefilters (Semrock, Lake Forest, IL, VS) 520/35 voor groene kleurstof (AF488) en 690/70 voor rode kleurstof (Atto647N) werden voor de detector gebruikt.Single-photon lawinediodes (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italië) werden als detectoren gebruikt.Zowel het verzamelen als analyseren van gegevens werd uitgevoerd met behulp van de in de handel verkrijgbare SymphoTime64-software (PicoQuant GmbH, Berlijn, Duitsland).
Vijftig microliter LLPS-monsters werden aangebracht op μ-Slide-angiogeneseputjes (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Duitsland).De resulterende beelden worden gefocust tot 20 µm boven de bodem van de put voor een optimale objectieve werkafstand voor zwevende druppels en tot ~1 µm voor vlotten en punten met een axiale resolutie van ten minste 0,25 µm/pixel en een vertragingstijd van 400 µs/pixel.Selecteer gegevens door een intensiteitsdrempel toe te passen op basis van de gemiddelde achtergrondsignaalintensiteit (PBG, gemiddelde + 2σ) voor elk kanaal, zodat alleen vloeibare eiwitdruppeltjes, vlotten of vlekken worden geselecteerd, waarbij elke mogelijke oorsprong uit de verspreide fase wordt gefilterd.Om de levensduur van elke soort (τ) van elk kanaal (groen, "g" voor AF488 en rood, "r" voor Atto647N) te analyseren, hebben we interessegebieden (ROI's) geselecteerd die druppels, vlotten of vlekken bevatten (aanvullende figuur 1 ).8b) en leidde ze af door hun levensduurverval (τD, τR en τP voor respectievelijk druppels, vlotten of vlekken, zie aanvullende figuur 8c) in elk kanaal aan te passen met behulp van een staartfitanalyse en een tweecomponentenvervalmodel.Gemiddelde τ vanaf τ .ROI's die te weinig fotonen produceerden voor een multi-exponentiële fit werden uitgesloten van de analyse.De gebruikte grenswaarde was <104 fotonen voor vlotten en stippen en 103 voor druppels.De druppels hebben een lagere drempel omdat het moeilijk is om vervalcurven met hogere intensiteitswaarden te verkrijgen, omdat de druppels in het beeldveld doorgaans kleiner en minder talrijk zijn.ROI's met fotonentellingen boven de fotonenaccumulatielimiet (ingesteld op >500 tellingen/pixel) werden ook voor analyse weggegooid.Zorg ervoor dat de intensiteitsvervalcurve, verkregen uit het interessegebied, overeenkomt met een intensiteit van 90% van het maximum (iets na de maximale intensiteit van het verval) vanaf het begin van de levensduur om minimale IRF-interferentie te garanderen, terwijl deze hetzelfde blijft voor alle intensiteitsverval instellingen Relatief tijdvenster Werd geanalyseerd 25 tot 50 ROI voor vlotten en spots en 15-25 ROI voor drops, beelden geselecteerd uit meer dan 4 replica's opgenomen van ten minste 3 onafhankelijke experimenten.Tweezijdige t-tests zijn gebruikt om statistische verschillen tussen soorten of tussen coacervaatsystemen te evalueren.Voor een pixel-voor-pixel analyse van de levensduur (τ) werd de totale verzwakking van de levensduur over het veld voor elk kanaal berekend en werd een benadering van een 2/3-component exponentieel verzwakkingsmodel uitgevoerd.De levensduurverzwakking voor elke pixel werd vervolgens aangepast met behulp van eerder berekende τ-waarden, resulterend in een pseudokleuren FLIM-fitbeeld.Het levensduurbereik van de staartpassing was hetzelfde voor alle afbeeldingen van hetzelfde kanaal, en elk verval produceerde voldoende fotonen om een ​​betrouwbare pasvorm te bieden.Voor FRET-analyse werden pixels geselecteerd door een lagere intensiteitsdrempel van 100 fotonen toe te passen, wat een gemiddelde achtergrondsignaal (FBG) van 11 fotonen opleverde.De fluorescentie-intensiteit van elk kanaal werd gecorrigeerd door experimenteel bepaalde correctiefactoren: 69 spectrale overspraak α was 0,004, directe excitatie β was 0,0305, detectie-efficiëntie γ was 0,517.De FRET-efficiëntie op pixelniveau wordt vervolgens berekend met behulp van de volgende vergelijking:
waarbij FDD de fluorescentie-intensiteit is die wordt waargenomen in het donorkanaal (groen), FDA de fluorescentie-intensiteit is die wordt waargenomen in het acceptorkanaal (rood) onder indirecte excitatie, en FAA de fluorescentie-intensiteit is die wordt waargenomen in het acceptorkanaal (rood) onder directe excitatie ( TAART).In het kanaal worden fluorescentie-intensiteitspulsen waargenomen).
Plaats 100 µl LLPS-reactieoplossingen die 25 µM ongelabeld monomeer Tau441 (met of zonder 25 µM αS) bevatten in LLPS-buffer (aangevuld zoals hierboven) op niet-bindende microplaten met 96 putjes met zelfklevende foliecoating en de druppelvorming werd daarna gecontroleerd met WF-microscopie. evenwicht.binnen 10 minuten.Na 48 uur incubatie bij kamertemperatuur werd de aanwezigheid van eiwitvlotten en vlekken bevestigd.Verwijder vervolgens voorzichtig de vloeistof over de vlotten uit de putten, voeg vervolgens 50 L dissociatiebuffer toe (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) en incubeer gedurende 10 minuten.De hoge zoutconcentratie zorgt ervoor dat LLPS zich niet zal herhalen als gevolg van achtergebleven PEG, en dat mogelijke eiwitassemblages die alleen door elektrostatische interacties worden gevormd, zullen worden gedemonteerd.De bodem van het putje werd vervolgens voorzichtig afgeschraapt met een micropipetpunt en de resulterende oplossing werd overgebracht naar een lege observatieput.Na incubatie van de monsters met 50 μM ThT gedurende 1 uur werd de aanwezigheid van geïsoleerde vlekken gecontroleerd met behulp van WF-microscopie.Bereid gesoniceerde αS-fibrillen door 300 μl van een 70 µM αS-oplossing in PBS met pH 7,4, natriumazide 0,01% bij 37 ° C en 200 rpm gedurende 7 dagen op een orbitaal schudapparaat te incuberen.De oplossing werd vervolgens 30 minuten bij 9600 x g gecentrifugeerd, de pellet werd opnieuw gesuspendeerd in PBS pH 7,4 en gesoniceerd (1 min, 50% cyclus, 80% amplitude in een Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, VS) fibrilmonsters. met een relatief uniforme grootteverdeling van kleine fibrillen.
FCS / FCCS-analyse en tweekleurige coïncidentiedetectie (TCCD) werden uitgevoerd op dezelfde MT200 tijdsopgeloste fluorescerende confocale microscoop (Pico-Quant, Berlijn, Duitsland) die werd gebruikt voor de FLIM-FRET-microscopie-experimenten met behulp van de PIE-modus.Het laservermogen voor deze experimenten werd opgeteld tot 6,0 µW (481 nm) en 6,2 µW (637 nm).De combinatie van deze laservermogens werd gekozen om een ​​vergelijkbare helderheid te produceren voor de gebruikte paren fluoroforen, terwijl optimale telsnelheden werden bereikt en fotobleken en verzadiging werden vermeden.Zowel het verzamelen als analyseren van gegevens werd uitgevoerd met behulp van de in de handel verkrijgbare SymphoTime64 versie 2.3-software (PicoQuant, Berlijn, Duitsland).
Monsters van geïsoleerde αS/Tau-aggregaten verkregen met behulp van LLPS worden in isolatiebuffer verdund tot de juiste monomoleculaire concentratie (doorgaans een verdunning van 1:500, aangezien aggregaten al in lage concentraties verkeren wanneer ze worden geïsoleerd uit coacervaatmonsters).Monsters werden rechtstreeks aangebracht op dekglaasjes (Corning, VS) die vooraf waren bekleed met een BSA-oplossing in een concentratie van 1 mg/ml.
Voor de PIE-smFRET-analyse in de groene en rode kanalen werd een lagere intensiteitsdrempel van 25 fotonen toegepast om signalen met lage intensiteit veroorzaakt door monomere gebeurtenissen uit te filteren (merk op dat er meer monomeren zijn dan geaggregeerde monsters in vergelijking met geïsoleerde aggregaten).Deze drempel werd berekend als vijf keer de gemiddelde intensiteit van monomeer aS verkregen uit de analyse van zuivere monomeermonsters om specifiek aggregaten voor analyse te selecteren.Het PIE-aandrijfcircuit heeft, samen met TSCPC-data-acquisitie, de toepassing mogelijk gemaakt van een levenslange weegfilter dat achtergrond- en spectrale overspraak helpt elimineren.De flare-intensiteit die werd geselecteerd met behulp van de bovenstaande drempels, werd gecorrigeerd met behulp van het gemiddelde achtergrondsignaal dat werd bepaald uit de histogrammen van optreden versus intensiteit/bin van de alleen-buffermonsters.Bursts die verband houden met grote aggregaten bezetten doorgaans meerdere opeenvolgende bins in de tijdtrace (ingesteld op 1 ms).In deze gevallen werd gekozen voor een bak met maximale sterkte.Voor FRET- en stoichiometrische analyse werd de theoretisch bepaalde gammafactor y (0,517) gebruikt.Spectrale overspraak en directe excitatiebijdragen zijn verwaarloosbaar (experimenteel bepaald) bij het gebruikte excitatielaservermogen.De efficiëntie en stoichiometrie van FRET bij een explosie worden als volgt berekend.