347 roestvrij stalen chemische component met opgerolde buizen, Identificatie van nieuwe interferon-responsieve menselijke leukocytenantigeen-A (HLA-A) chaperonne-eiwitten met behulp van cross-linked massaspectrometrie (CLMS)

Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden wij u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Sliders met drie artikelen per dia.Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door de dia's te bladeren, of de knoppen op de schuifregelaar aan het einde om door elke dia te bladeren.

Productomschrijving

Roestvrijstalen 347L spiraalbuizen, staalkwaliteit: SS347L

Het interferonsignaleringssysteem induceert een sterke cytokinereactie op een breed scala aan pathogene en intrinsieke pathologische signalen uit de omgeving, resulterend in de inductie van subsets van door interferon induceerbare eiwitten.We hebben DSS-gemedieerde cross-link massaspectrometrie (CLMS) toegepast om nieuwe eiwit-eiwitinteracties in het domein van door interferon geïnduceerde eiwitten te detecteren.Naast de verwachte interferon-induceerbare eiwitten, hebben we ook nieuwe intermoleculaire en intramoleculaire verknoopte adducten van canonieke interferon-induceerbare eiwitten zoals MX1, USP18, OAS3 en STAT1 geïdentificeerd.We concentreerden ons op orthogonale validatie van een nieuwe reeks interferon-induceerbare eiwitnetwerken gevormd door HLA-A-eiwitten (H2BFS-HLA-A-HMGA1) met behulp van co-immunoprecipitatie en hun verdere studie met behulp van moleculaire dynamica-modellering.Modellering van de conformationele dynamiek van het eiwitcomplex bracht verschillende interactieplaatsen aan het licht die de interacties weerspiegelden die in de CLMS-bevindingen waren geïdentificeerd.Samen presenteren we een pilotstudie van CLMS om nieuwe signaalcomplexen te identificeren die worden geïnduceerd door interferon, en kijken we uit naar het bredere gebruik van CLMS om nieuwe dynamieken van eiwitinteracties in de micro-omgeving van de tumor te identificeren.
Voordat een adaptieve immuunrespons begint, brengt het aangeboren afweersysteem van de gastheer een antimicrobiële respons op gang die wordt gemedieerd door een familie van uitgescheiden alfa-helixcytokinen die interferonen (IFN's) worden genoemd.De type I IFN-klassen IFNa en IFNβ activeren cellulaire reacties, waaronder antivirale, proapoptotische, pro-inflammatoire en antiproliferatieve toestanden.Bij mensen zijn 13 subtypes van IFNα bekend, allemaal geclusterd op chromosoom 91. Verrassend genoeg is alleen IFNα2 onderzocht voor klinisch gebruik.Onlangs is er speciale aandacht besteed aan onderzoek naar andere subtypes van IFNα.Een recente studie heeft aangetoond dat IFNα14 een van de meest effectieve isovormen is bij het beperken van de replicatie van HBV2 en HIV-13,4 vergeleken met het canonieke IFNα2-subtype.
Er is vastgesteld dat geactiveerde type I interferonreceptorcomplexen (IFNAR1 en IFNAR2) een signaaltransductiecascade teweegbrengen die wordt gemedieerd door Janus-kinasen TYK2 en JAK15,6.Deze Janus-kinasen fosforyleren signaaltransducers en transcriptionele eiwitactivatoren (STAT1 en STAT2) op tyrosineresiduen om SH2-domein-gemedieerde heterodimerisatie te initiëren.Vervolgens bindt IRF9 STAT-heterodimeren om een ​​trimeercomplex van het IFN-gestimuleerde factor 3-gen (ISGF3) te vormen, dat zich naar de kern verplaatst en de transcriptie van meer dan 2000 door interferon gestimuleerde genen (ISG's) induceert5,6,7,8.
ISG's vormen de ruggengraat van het aangeboren immuunsysteem, vooral als reactie op een virale aanval.Als eerste verdedigingslinie tegen virale infecties zetten cellen snel uitgebreide interacties in van cellulaire eiwitten met een breed scala aan biologische activiteiten.Deze eiwitten omvatten patroonherkenningsreceptoren, signaalmoleculen, transcriptiefactoren en eiwitten met directe antivirale functies, evenals negatieve regulatoren van immuunreacties9.Veel van de informatie over ISG-activiteit is afkomstig van functionele screenings met behulp van overexpressieschermen10,11 of genuitschakelingstechnieken (siRNA, RNAi en CRISPR)12,13 waarin individuele ISG's tot expressie worden gebracht of geremd en hun activiteit op verschillende virussen wordt getest.Hoewel deze onderzoeken de antivirale eigenschappen van individuele ISG's hebben bepaald, blijven de onderliggende moleculaire mechanismen van elke ISG grotendeels onbekend.Het is algemeen aanvaard dat veel eiwitten een interactie aangaan met een of meer cytokines om volledige activiteit te garanderen, dus interageren ISG's rechtstreeks of hun interacties worden gemedieerd door cellulaire eiwitten.Een recent fotocrosslinked proteomics-onderzoek identificeerde bijvoorbeeld ATPase VCP/p97 als een belangrijke IFITM3-interactiepartner, wiens remming leidt tot defecten in de lysosomale sortering, omzet en co-transport van IFITM3 met virale deeltjes 14 .Met behulp van immunoprecipitatie hebben we VAPA, een blaasjesgeassocieerd eiwit, geïdentificeerd als een interactiepartner met IFITM1/2/3 die de door cholesterol gemedieerde virale rijping medieert, en dit werd bevestigd door een ander onderzoek waarbij gebruik werd gemaakt van een twee-hybride gistsysteem.Wetenschappelijke ondersteuning 15 , 16 .
Een fundamenteel biologisch proces dat betrokken is bij de onderdrukking van infectie en kwaadaardige transformatie is de presentatie van antigeen, dat wordt gemedieerd door belangrijke histocompatibiliteitscomplex (MHC) moleculen.Peptiden (8-12 aminozuren lang) van gesplitste, voortijdig beëindigde of verkeerd gevouwen eiwitten worden geladen in het MHC-I heterodimeer (bestaande uit zware en lichte MHC-I-ketens, genaamd β-2-microglobuline; β2M) 17,18.De resulterende stabiele MHC-I-trimeren worden naar het celoppervlak getransporteerd, waar ze intracellulaire peptiden presenteren aan CD8+ T-cellen (cytotoxische T-cellen)17.T-cellen herkennen en vernietigen deze ziekteverwekkers en cellen die een tumorspecifiek antigeen dragen.Dientengevolge onderdrukken pathogenen en tumorcellen vaak het antigeenpresentatieproces om immuunbewaking te vermijden.Bovendien wordt MHC-I bij 40-90% van de menselijke tumoren gedownreguleerd en wordt dit vaak geassocieerd met een slechtere prognose19.
Genen die betrokken zijn bij het reageren op ziekteverwekkers moeten snel schakelen tussen een staat van rust en een staat van actieve transcriptie.Daarom wordt verondersteld dat verschillende cellulaire eiwitten betrokken zijn bij de reactie op de hoge vraag naar IFN gedurende korte perioden, inclusief hermodellering en modificatie van promoterchromatine 20,21.De meeste onderzoeken hebben zich gericht op de identificatie van individuele ISG-eiwitpartners in de aanwezigheid van IFN.Verschillende proteomische en transcriptomische onderzoeken in modelcelsystemen hebben het effect van IFN op het cellulaire landschap opgehelderd.Ondanks een groeiend begrip van de dynamiek die door interferonen wordt veroorzaakt, weten we echter nog steeds weinig over de betrokkenheid van ISG's.Wanneer we de complexiteit en tijdsafhankelijke dynamiek van interferonsignalering in ogenschouw nemen, rijzen er twee vragen: (i) is het mogelijk om de multiproteïnecomplexen die betrokken zijn bij snelle signalering te stabiliseren en op te vangen, en (ii) kunnen deze interacties in kaart worden gebracht in de 3D-ruimte?
Om deze problemen aan te pakken, hebben we disuccinimide-suberaat-gemedieerde chemische verknoping (DSS) geïmplementeerd in combinatie met massaspectrometrie (CLMS) om het IFNα-geïnduceerde eiwitinteractienetwerk en de dynamiek ervan te bestuderen.DSS voegt in vivo covalente bindingen toe tussen proximale residuen van eiwitten en/of eiwitcomplexen.Daaropvolgende MS-analyse onthult specifieke verknopingsplaatsen die de ruimtelijke nabijheid van regio's binnen een bepaald eiwit weerspiegelen, interne koppelingen genoemd, of subeenheden in eiwitcomplexen, onderlinge relaties genoemd.Met behulp van deze aanpak hebben we verschillende nieuwe eiwit-eiwitcomplexen geïdentificeerd, evenals door interferon geïnduceerde multi-eiwitinteractienetwerken.Door een subset van deze nieuwe interacties verder te testen, laten we zien dat H2BFS (H2B histon-type FS; hierna H2B genoemd) en MDN1 fungeren als bindingspartners voor HLA-A.
Flo-1-cellen zijn een van de bekendste in vitro modellen van slokdarmadenocarcinoom omdat ze de belangrijkste kenmerken van slokdarmtumoren nabootsen22,23.Niet alle tumoren zijn echter immunogeen, en om te bepalen of Flo-1-cellen reageren op behandeling met interferon, behandelden we Flo-1-cellen gedurende 72 uur met 10 ng/ml IFNα.Flo-1-cellen vertoonden vroege inductie van pSTAT1 en IRF1, beginnend 2 uur na de behandeling en gedurende 72 uur, met een tijdsafhankelijke afname van stationaire niveaus van IRF1 (Figuur 1A).ISG's (MX1, IFITM1, OAS1/2 en ISG15) bleken na 6 uur sterk geïnduceerd te zijn, wat de klassieke midden- en late fasereacties op IFNα nabootst (Figuur 1A).Samen suggereren deze gegevens dat dit cellulaire model kan worden gebruikt om interferonreacties te bestuderen.
Differentiële eiwitexpressiereacties in Flo-1-cellen na IFNa-behandeling.(A) Eiwitexpressie in Flo-1-cellen behandeld met 10 ng/ml IFNa gedurende 2, 6, 24, 48 en 72 uur werd geanalyseerd door middel van immunoblot met behulp van de aangegeven ISG-antilichamen.(B) Coomassieblauw gekleurde SDS-PAGE-gels van volledige celextracten na verknoping met DSS gedurende aangegeven tijden en concentraties.(C) Representatieve immunoblot onderzocht met p53(DO-1)-antilichaam uit dezelfde monsters om de mate van eiwitverknoping te beoordelen.
Om het in situ eiwitinteractielandschap vast te leggen, hebben we DSS gebruikt, een veelgebruikt verknopingsmiddel vanwege de hoge membraanpermeabiliteit en relatief korte reactietijd.De kortere reactietijd helpt de vorming van grote aggregaten van verknoopte eiwitten te voorkomen, waardoor de stabiliteit van de verknoper behouden blijft.Om de optimale DSS-concentratie te bepalen en oververknoping te voorkomen, hebben we de cellen eerst blootgesteld aan 5, 2,5 en 1 mM DSS gedurende respectievelijk 5, 10, 5 en 30 minuten, en de lysaten geanalyseerd met Coomassie-gekleurde SDS-PAGE (data niet weergegeven) .Cellysaten lijken in hoge mate verknoopt te zijn bij de laagste concentratie en op het kortste tijdstip.Daarom werd DSS gedurende 5 minuten getitreerd naar 1, 0,5 en 0,1 mM (Figuur 1B).Optimale verknoping werd waargenomen met 0,5 mM DSS gedurende 5 minuten, en deze omstandigheden werden gekozen voor cellen behandeld met IFNa.Bovendien toont Figuur 1C een Western blot uitgevoerd met behulp van het p53 (DO-1) antilichaam om de mate van eiwitverknoping te beoordelen.
Flo-1-cellen werden gedurende 24 uur behandeld met 10 ng/ml IFNa voordat de verknoper werd toegevoegd.Verknoopte cellen werden vervolgens gelyseerd door proteolyse in twee stappen en eiwitten werden verwerkt door FASP (Fig. 2) 24,25.Verknoopte tryptische peptiden werden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie (Fig. 2).De MS/MS-spectra worden vervolgens gekoppeld aan de eiwitsequentie en gekwantificeerd met MaxQuant26,27.Verknoopte peptiden werden geïdentificeerd uit de verkregen spectra met behulp van het SIM-XL-programma, en individuele verbindingen werden gecombineerd tot een complex netwerk met behulp van de xQuest28 en SIM-XL29 open source computersoftwarepijplijnen (Fig. 2).SIM-XL identificeert eiwit-eiwit-interacties, interne ketens en individuele ketens in eenvoudige of complexe eiwitmengsels en biedt scripts voor het visualiseren van interacties in eiwitstructuren.Bovendien rangschikt het elke kruisverwijzing als een ID-score volgens de MS/MS29-spectrumkwaliteit.Er zijn verschillende zeer betrouwbare eiwit-eiwitinteracties en -complexen geïdentificeerd, en een nieuwe reeks interacties is verder onderzocht met behulp van co-immunoprecipitatie en conformationele veranderingen van complexen met behulp van moleculaire dynamica (MD)-modellering (Fig. 2) 30, 31.
Schematisch overzicht van de CLMS-methode.Flo-1-cellen werden gedurende 24 uur behandeld met 10 ng/ml IFNa, gevolgd door in situ eiwitverknoping met behulp van DSS, gevolgd door cellyse en trypsinisatie.Verknoopte monsters werden geanalyseerd met behulp van een Orbitrap-massaspectrometer en verder bemonsterd op fragmentatie van peptidevoorlopers tijdens LC-MS/MS.Twee gekoppelde peptiden werden geïdentificeerd uit de verkregen spectra met behulp van het Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL) programma, en alle verbindingen werden gecombineerd tot een complex netwerk met behulp van computationele pijpleidingen.Filter interacties met weinig vertrouwen uit op basis van fout-positieve scores (FDR).Verschillende nieuwe high-fidelity eiwit-eiwit-interacties werden verder bevestigd met behulp van co-immunoprecipitatie, en conformationele veranderingen in de complexen werden onderzocht met behulp van moleculaire dynamica (MD)-modellering.
Een totaal van ~30.500 en ~28.500 peptiden werden gedetecteerd met behulp van MaxQuant in respectievelijk ongestimuleerde en gestimuleerde IFNa-monsters (aanvullende tabel S1, figuur 3A).De peptidelengteverdeling vertoonde in beide gevallen een groter aandeel grotere peptiden, wat de aanwezigheid van verknoopte peptiden aangeeft (Fig. 3B,C).Bovendien was een groter deel van de grotere peptiden aanwezig in het bereik van 40-55 in met IFNa behandelde monsters (Fig. 3C).Eiwitmapping tegen de log2-intensiteit toonde aan dat klassieke, door interferon gestimuleerde eiwitten het meest voorkomend waren in vergelijking met onbehandelde monsters, waaronder MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 en HLA-F (Figuur 3D).Analyse van routes voor eiwitten die meer dan drievoudig verrijkt zijn als reactie op IFNα-behandeling met behulp van de Reactome-routedatabase toonde aan dat MHC-I-gemedieerde antigeenpresentatie en -verwerking de meest dominante route was (Figuur 3E).In overeenstemming met eerdere rapporten behoorden antivirale reacties gemedieerd door OAS en ISG15, evenals IFNα/β en cytokinesignalering tot de geactiveerde routes.Bovendien werden lysine- en serine-specifieke eiwitverknopingen geïdentificeerd uit de oorspronkelijk verkregen MS/MS-spectra met behulp van SIM-XL.Een recente studie rapporteerde 104 ISG's verspreid over 20 virussen uit 9 virusklassen door meta-analyse van individuele ISG-overexpressiestudies in 5 celtypen .Om de computationele beperkingen van het screenen van grote datasets te overwinnen, zijn we echter begonnen met een kleinere dataset om mogelijke interacties te onderzoeken tussen de lijst met IRDS-genen gerapporteerd door Padaria et al., waarvan de meeste ISG's zijn.
Identificatie van differentieel tot expressie gebrachte verknoopte eiwitten als reactie op IFNa (gegevens verkregen van MaxQuant).(A) Venn-diagram dat het aantal algemene en exclusieve peptiden weergeeft dat is geïdentificeerd in met IFNa14 behandelde en onbehandelde Flo-1-monsters.Peptidelengteverdeling van onbehandelde (B) en met IFNa behandelde (C) verknoopte monsters.(D) Warmtekaart die log2 (LFQ-intensiteit) weergeeft tussen onbehandelde en met IFNα14 behandelde Flo-1-cellen.Het linkerpaneel toont de eiwitten die het meest actief worden geactiveerd in de aanwezigheid van IFNa.(E) Histogram dat de 20 belangrijkste verrijkingsroutes na IFNα-behandeling weergeeft.De Reactome-routedatabase analyseerde meer dan viervoudige veranderingen in opreguleerde IFNα-responsieve eiwitten.
Interferon-gemedieerde ISG-stimulatie is goed gedocumenteerd, maar op moleculair niveau wordt slecht begrepen hoe deze eiwitten culmineren in een breed scala aan biologische functies.We onderzochten eiwitinteracties met een hoge mate van vertrouwen tussen bekende ISG's.Interessant genoeg hebben we een netwerk geïdentificeerd dat MX1-, USP18-, ROBO1-, OAS3- en STAT1-eiwitten omvat die een groot complex vormen als reactie op IFNα-behandeling (Figuur 4, Tabel S2) 32,33,34.Het belangrijkste is dat deze interacties werden aangetroffen in alle triplo's behandeld met IFNa en niet in onbehandelde monsters, wat suggereert dat ze specifiek werden gevormd als reactie op behandeling met IFNa.Het is bekend dat STAT1 de expressie van deze ISG's transcriptioneel reguleert, maar de interactie ervan met ISG's op eiwitniveau is niet onderzocht.De kristalstructuur van STAT1 toonde aan dat het helixdomein (CCD) niet betrokken is bij de interactie met DNA of protomeren tijdens de vorming van dimeren35.Deze α-helices vormen een spiraalvormige helixstructuur die een overwegend hydrofiel oppervlak biedt waar interacties kunnen plaatsvinden 35 .In onze CLMS-gegevens hebben we waargenomen dat de meeste interacties met STAT1 plaatsvonden in het SH2-domein voorafgaand aan de CCD, het linkerdomein of de C-terminale staart (residuen 700-708) (Figuur 4A).Een eerdere studie rapporteerde dat USP18 bindt aan het CCD en DNA-bindende domein (DBD) van STAT2 en wordt gerekruteerd in de subeenheid van de type I interferonreceptor IFNAR2 om remming van type I interferonsignalering te mediëren 24 .Onze gegevens toonden ook aan dat het katalytische domein van USP18 interageert met STAT1 DBD (Figuur 4A,D), wat suggereert dat zowel STAT1 als STAT2 een rol kunnen spelen bij het aantrekken van USP18 naar IFNAR2.
Eiwit-eiwit ISG-netwerk geïdentificeerd in verknoopte cellen behandeld met IFNα.(A) 2D-interactieplot dat eiwit-eiwitinteracties toont (gegenereerd in het SIM-XL-programma), met lijnen die intermoleculaire interacties vertegenwoordigen (crosslink-cutoff ingesteld op 3,5).Domeinen met verschillende identiteiten worden gemarkeerd door hun kleur: MX1-domein, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) en GED (569–660).OAS3-domeinen: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) en OAS1_C (903-108).Domein ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) en fn3 (777–864).STAT1-velden: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) en STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Cirkelvormige kijker van verknoopte eiwitten (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 en STAT1) met respectievelijk interacties en interacties gelabeld in blauw en rood.De verknopingsdrempel werd vastgesteld op 3,5.Puntdiagrammen geven STAT1-interactieplaatsen aan met MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) en OAS3 (F), evenals K- of S-interactieplaatsen tussen de twee peptiden.In de afbeelding is de drempelwaarde voor de cross-linkscore ingesteld op 3,0.(G) Verschillende interactieplaatsen tussen STAT1- en OAS3 DI-domeinen bovenop hun eiwitstructuren in PyMol (PyMOL moleculair grafisch systeem, versie 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb-id: 1bf533) en OAS3 (pdb-id: 4s3n34).) programma.
Bij mensen zijn twee isovormen van USP18 beschreven: een eiwit met de volledige lengte dat zich voornamelijk in de kern bevindt, en een isovorm zonder een N-terminaal domein, USP18-sf, die gelijkmatig verdeeld is in het cytoplasma en de kern 36 .Bovendien werd voorspeld dat de N-terminus ongestructureerd is en geen isopeptidase-activiteit of ISG1537-binding vereist.De meeste interacties die in onze studie zijn geïdentificeerd, bevonden zich aan de N-terminus van het eiwit, wat suggereert dat deze interacties USP18 over de volledige lengte omvatten (Figuur 4A, D) en dus waarschijnlijk in de kern voorkomen.Bovendien geven onze gegevens ook aan dat het N-uiteinde gespecialiseerd is in eiwit-eiwitinteracties.De IFNAR2-bindingsplaats bevindt zich tussen de residuen 312-368, en met name bindt geen van de eiwitten in het complex aan dit gebied (Fig. 4A) 37,38.Deze gegevens samen geven aan dat het IFNAR2-bindende domein uitsluitend door het receptoreiwit wordt gebruikt.Bovendien bleken alleen OAS3 en ROBO1 geassocieerd te zijn met domeinen stroomopwaarts van de N-terminus en IFNAR2-bindingsplaats (Figuur 4A).
ROBO1 behoort tot de immunoglobuline (Ig)-superfamilie van transmembraansignaleringsmoleculen en bestaat uit vijf Ig-domeinen en drie fibronectine (Fn)-domeinen in het extracellulaire gebied.Deze extracellulaire domeinen worden gevolgd door een membraan-proximaal gebied en een enkele transmembraanhelix 39. Een ongestructureerd intracellulair gebied bevindt zich aan de C-terminus en bevat geconserveerde sequentiemotieven die de binding van effectoreiwitten mediëren39.Het gebied dat zich uitstrekt van aminozuren ~1100 tot 1600 is grotendeels ongeordend.We ontdekten dat MX1 interageert met ROBO1 via Ig-, Fn- en intracellulaire domeinen, terwijl de meeste interacties met STAT1 plaatsvinden tussen zijn CCD, linkerdomein en de C-terminus van ROBO1 (Fig. 4A, E).Aan de andere kant werden interacties met DI-, DIII- en OAS3-linkergebieden verdeeld over het ROBO1-eiwit (Fig. 4A).
De oligoadenylaatsynthase (OAS) eiwitfamilie accepteert en bindt intracellulair dubbelstrengs RNA (dsRNA), ondergaat conformationele veranderingen en synthetiseert 2′,5′-gekoppelde oligoadenylaten (2-5 As) 40 .Er werd gevonden dat OAS3 van de drie OAS's de hoogste affiniteit voor dsRNA vertoont en de minste hoeveelheid 2-5 As synthetiseert, wat RNase L kan activeren en daardoor de virale replicatie kan beperken 41 .De OAS-familie bestaat uit polymerase bèta (pol-β)-achtige nucleotidetransferasedomeinen.Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de katalytische activiteit van het C-terminale domein (DIII) afhankelijk is van het dsRNA-bindende domein (DI), dat nodig is voor de activering van OAS342.We hebben waargenomen dat de DI- en DII-domeinen van OAS3 interageren met CCD en een klein verbindingsgebied tussen SH2 en STAT1 TAD (Figuur 4A, F).Het over elkaar leggen van verschillende verknopingsplaatsen op de eiwitstructuur onthulde een interactie tussen de β-sheet en de DBD STAT1-lus en een open pocket of holte gevormd door residuen 60-75 in het DI-domein van OAS3 (Fig. 4G).De oriëntatie van de eiwitten in het complex gaf ook aan dat geen van de interacties met OAS3 het DNA-bindende vermogen van zijn DI-domein verstoorde (Fig. S1A).Bovendien interageert het N-terminale domein van GTPase MX1 uitgebreid met de DI- en DIII-domeinen van OAS3 (Fig. 4A).We hebben ook een interactie waargenomen tussen OAS1 en MX1 in alle drie de met IFNα behandelde herhalingen, waarbij een enkel OAS1-domein (ook katalytisch actief) interactie had met alle drie MX1-domeinen (Figuur S2A, B).
MX-eiwitten maken deel uit van een grote familie van dyneïne-achtige GTPasen die een N-terminaal GTPase-domein bevatten dat GTP bindt en hydrolyseert, een tussenliggend domein dat zelfassemblage bemiddelt, en een C-terminale leucinerits die fungeert als een GTPase (LZ). ).domeineffectordomein25,43.MX1 bindt zich aan subeenheden van virale polymerasen om de transcriptie van het virale gen te blokkeren43.Een eerder gerapporteerde gist twee-hybride screening toonde aan dat PIAS1-geassocieerde MX1 STAT1-gemedieerde genactivatie remt door DNA-bindende activiteit te blokkeren en ook SUMO E344,45-ligase-activiteit heeft.Hier demonstreren we dat MX1 bindt aan STAT1 (Figuur 4C,D), maar hoe deze interactie de STAT1-gemedieerde genactivatie beïnvloedt als reactie op IFNα moet verder worden onderzocht.Bovendien ontdekten we ook dat MX1 een interactie aanging met IFIT3 en DDX60 in alle drie de met IFNα behandelde herhalingen (Fig. S2C).
DDX60 is een door IFN geïnduceerde cytoplasmatische helicase waarvan eerder is gerapporteerd dat deze een rol speelt bij RIG-I-onafhankelijke afbraak van viraal RNA46.Het interageert met RIG-I en activeert de signalering ervan op een ligandspecifieke manier 46. DDX60 bestaat uit een DEXD/H-Box-helicasedomein en een C-terminaal helicasedomein die viraal RNA en DNA binden47.De meeste interacties met MX1 en IFIT3 vinden plaats in lange N- en C-terminale gebieden zonder canonieke domeinen of motieven (Fig. S2E, F).MX1 wordt echter ook geassocieerd met het DEXD/H-Box helicasedomein (Fig. S2E).Eiwitten van de IFIT-familie hebben tandemkopieën van een kenmerkend helix-turn-helix-motief dat de tetrapeptide-herhaling (TPR) wordt genoemd.IFIT3 bleek een positieve modulator van RIG-I-signalering te zijn en daarmee een component van het MAVS-complex.Alles bij elkaar suggereren onze gegevens dat IFIT3 en DDX60 voornamelijk interageren in het gebied tussen TPR 3-6 van IFIT3 en mogelijk een rol spelen bij RIG-I / MAVS-signalering (Fig. S2F).
Gegeven dat het screenen van het gehele proteoom rekenintensief is, hebben we vervolgens de gehele menselijke UniProt-database gescreend op de aanwezigheid van een van de met IFNα behandelde herhalingen.In deze replica hebben we verschillende zeer betrouwbare interactienetwerken voor HLA-A gevonden.Analyse van eiwitroutes geïdentificeerd door MS/MS-spectra toonde aan dat op MHC-I gebaseerde antigeenverwerking en -presentatie de belangrijkste route is die wordt geïnduceerd door interferon (Fig. 3D).Daarom hebben we ons geconcentreerd op het bestuderen van de eiwitinteracties van MHC-I-moleculen met een hoge mate van vertrouwen in alle verknoopte monsters.HLA bestaat uit α1-, α2- en α3-domeinen en lichte ketens, en microglobuline β2 (β2m) is een constant chaperonne-eiwit49.Eenmaal geassembleerd in het endoplasmatisch reticulum, is HLA onstabiel bij afwezigheid van peptideliganden50.De peptidebindende groef wordt gevormd door de zeer polymorfe en ongestructureerde α1- en α2-domeinen in niet-peptidevorm en het relatief minder polymorfe α351-domein.In aanwezigheid van IFNα hebben we twee HLA-A-complexen gedetecteerd: de ene interageert met HMGA1 en H2B (Figuur 5, Tabel S3) en de andere interageert met MDN1, LRCH4 en H2B (Figuur 6).
IFNα induceert een HLA-A-interactienetwerk met H2B (H2BFS) en HMGA1.(A) 2D-plot (gegenereerd in SIM-XL-software) met verschillende soorten interacties in het H2B-HLA-A-HMGA1-complex: interlink (blauw), interlink (rood) en enkele link (zwart)..Domeinen met verschillende identiteiten hebben een kleurcode32: H2B (histone; 2–102) en MHC-I (MHC_1; 25–203, groep C1; 210–290 en MHC_I_C; 337–364).De verknopingsdrempel werd vastgesteld op 3,5.Puntdiagrammen geven HLA-A-interactieplaatsen aan met H2B (B) en HMGA1 (C), evenals K- of S-interactieplaatsen tussen de twee peptiden.In de afbeelding is de drempelwaarde voor de cross-linkscore ingesteld op 3,0.(D) Relaties tussen eiwitten getoond in de structuren van de H2B-, HLA-A- en HMGA1-eiwitten in het PyMOL-programma.Deze structuren werden gemodelleerd met behulp van de Phyre2-server (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) en de sjabloonstructuren voor de H2B-, HLA-A- en HMGA1-eiwitten waren respectievelijk 1kx552, 1kj349 en 2eze55.
IFNα induceert een HLA-A-interactienetwerk met H2B (H2BFS), MDN1 en LRCH4.(A) Intramoleculaire (rode) en intermoleculaire (blauwe) crosslinks gepresenteerd op een 2D interactieve kaart (gegenereerd in SIM-XL-software) waarbij MDN1 wordt weergegeven als een cirkel.De verknopingsdrempel werd vastgesteld op 3,5.Domeinen met verschillende identiteiten hebben een kleurcode32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, groep C1; 210–290 en MHC_I_C; 337–364) en LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) en CH (535–641)).(B) Relaties tussen eiwitten getoond in de structuren van de H2B-, HLA-A-, LRCH4- en MDN1-eiwitten in het PyMOL-programma.Deze structuren werden gemodelleerd met behulp van de Phyre2-server (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) met sjabloonstructuren 1kx552, 1kj349, 6hlu62 en 6i2665 voor de H2B-, HLA-A-, LRCH4- en MDN1-eiwitten, respectievelijk.Puntdiagrammen die K- of S-interactieplaatsen tonen voor HLA-A met H2B (C), LRCH4 (D) en MDN1 (E).Voor plots werd de drempelwaarde voor de crosslinkscore ingesteld op 3,0.
Naast het behoud van de integriteit van het genoom, is histon H2B ook betrokken bij de regulatie van transcriptie.Het H2B-eiwit bestaat uit een centraal histondomein (HFD) gevormd door drie α-helices gescheiden door lussen en een C-terminale staart 41,52.Het grootste deel van de interactie met H2B vindt plaats in de α1-helix, die zorgt voor trimerisatie met het HFD-heterodimeer (Fig. 5A,B).Hoewel lysinen betrokken zijn bij DNA-binding, zijn sommige lysinen ook alternatieve acetylerings- of methyleringsplaatsen.De residuen K43, K46 en K57 van H2B zijn bijvoorbeeld niet betrokken bij directe DNA-binding, maar zijn doelwitten van verschillende post-transcriptionele modificaties53.Op soortgelijke wijze kunnen residuen K44, K47 en K57 in H2B een alternatieve rol spelen in de aanwezigheid van IFNa, inclusief interacties met andere eiwitten (Fig. 5A, B).Bovendien activeert het extrachromosomale histon H2B de immuunrespons in verschillende celtypen en fungeert het als een cytosolische sensor om dubbelstrengige DNA-fragmenten (dsDNA) te detecteren die afkomstig zijn van infectieuze agentia of beschadigde cellen54.In de aanwezigheid van DNA-virussen remde de H2B-uitputting de IFN-β-productie en STAT154-fosforylering.Het is ook bekend dat H2B sneller in en uit de kern beweegt dan andere kernhistones54.H2B-interacties met MDN1 en LRCH4 werden ook waargenomen in geselecteerde onbehandelde monsters.We ontdekten dat HLA-A een interactie aanging met H2B in alle drie de met IFNα behandelde monsters en in één onbehandeld herhaald monster.Deze gegevens weerspiegelen de rol van H2B in een alternatieve fysiologische functie, onafhankelijk van transcriptionele regulatie.
HMGA1 (hoge mobiliteitsgroep AT-Hook 1), een klein nucleoproteïne dat rijk is aan ziektebevorderende aminozuren, is geïdentificeerd in associatie met HLA-A.Het heeft een zure C-terminale staart en drie verschillende DBD's, AT-haken genoemd, omdat ze binden aan de kleine groef van het AT-rijke gebied in dsDNA.Deze binding zorgt ervoor dat het DNA buigt of rechttrekt, waardoor canonieke transcriptiefactoren toegang krijgen tot de consensussequentie.Aangenomen wordt dat de C-terminale staart betrokken is bij eiwit-eiwitinteracties en de rekrutering van transcriptiefactoren, omdat C-terminale deletiemutanten niet in staat zijn transcriptie te initiëren57.Bovendien bevat dit domein verschillende geconserveerde fosforyleringsplaatsen die bekende substraten voor kinasen zijn 58.We hebben HLA-A- en H2B-interacties met HMGA1 buiten het C-terminale domein waargenomen, wat suggereert dat het C-terminale domein voornamelijk wordt gebruikt voor transcriptiefactorbinding (Fig. 5A, C).HMGA-eiwitten concurreren met histon H1 voor binding aan adapter-DNA, waardoor de toegankelijkheid wordt vergroot57.Op dezelfde manier lijkt het waarschijnlijk dat HMGA een interactie aangaat met histon H2B langs het linker-DNA in competitie met histon H1.HMGB1 induceert de expressie van HLA-A, -B en -C in dendritische cellen, wat leidt tot hun activering59, maar een interactie tussen HMG en HLA is niet eerder gerapporteerd.We ontdekten dat HMGA1 interageert met de α1- en α3-domeinen van HLA-A, waarbij de meeste interacties buiten de 3 DBD liggen (Figuur 5A,C).In onze handen bleek HLA-A gelokaliseerd te zijn in de kern (gegevens niet getoond), en aangezien H2B en HMGA1 ook in de kern aanwezig zijn, vindt deze interactie waarschijnlijk in de kern plaats.Specifieke adducten gemeten tussen H2B, HLA-A en HMGA1 worden weergegeven in figuur 5D.
De meeste interacties van HLA-A met andere eiwitten vinden plaats binnen de α1- en α2-domeinen ervan en het ongeordende C-terminale domein (Fig. 6).In een van deze voorbeelden hebben we ontdekt dat HLA-A interageert met de ongeordende N-terminale staart van LRCH4 (Figuur 6A,D).LRCH4 reguleert TLR4-activering en LPS-cytokine-inductie, waardoor de aangeboren immuunrespons wordt gemoduleerd60,61.Het is een membraaneiwit met negen leucinerijke herhalingen (LRR's) en een calmoduline (CH)-homologiemotief in zijn ectodomein, gevolgd door een transmembraandomein (TMD) 60, 62.Er is gerapporteerd dat CH-domeinen eiwit-eiwitinteracties mediëren 60 .Een stuk van ongeveer 300 aminozuren tussen de LRR- en CH-domeinen is relatief toegankelijk maar ongeordend.Gebaseerd op de functie van ongeordende regio's als bemiddelaars van eiwit-eiwitnetwerken en vesiculair transport 63, hebben we ontdekt dat de meeste eiwitinteracties plaatsvinden in ongeordende regio's.Interacties met MDN1 waren verdeeld over de lengte van het eiwit, inclusief de LRR1-, LRR6-, CH-domeinen en willekeurige gebieden, terwijl H2B voornamelijk aan het CH-domein bond (Fig. 6A, B).Opvallend is dat geen van de interacties de TMJ omvatte, wat de specificiteit van de CLMS-aanpak suggereert (Figuur 6A, B).
MDN1 is ook geïdentificeerd als onderdeel van het HLA-A-eiwitnetwerk (Figuur 6A).Het behoort tot de AAA-familie van eiwitten (ATPasen geassocieerd met verschillende activiteiten).Dit is hetzelfde N-terminale AAA-domein dat zich organiseert in een hexamere ring en de assemblagefactor verwijdert uit de 60S 64 ribosomale subeenheid.lijkt vergelijkbaar te zijn met dyneïne64,65,66.Bovendien wordt het Asp/Glu-rijke gebied gevolgd door het MIDAS-domein (metaalion-afhankelijke plaats).Vanwege de grote omvang van MDN1 (ongeveer 5600 aminozuren) en de beperkte homologie ervan met goed bestudeerde eiwitten, is er weinig bekend over de structuur en functie ervan bij mensen.We identificeerden HLA-A, H2B en LRCH4 als MDN1-bindingspartners en onthulden hun oriëntatie als eiwitcomplexen in PyMol (Fig. 6A, B).Deze drie eiwitten interageren met het AAA-domein, het dyneïne-achtige linkerdomein en mogelijk het MIDAS MDN1-domein.In een eerder rapport identificeerde affiniteitszuivering van aaseiwitten MDN1 als een eiwit geassocieerd met histon H2B67.Bovendien rapporteerde een recente studie ook een interactie tussen MDN en HLA-B in HCT116-cellen met behulp van affiniteitsgezuiverde massaspectrometrie, wat onze bevindingen ondersteunt68.De identificatie van dit complex in met IFNa behandelde monsters suggereert een rol voor MDN1 bij interferonsignalering.
Omdat HLA-genen zeer polymorf zijn, hebben we de sequentiebepalingsgegevens die HLA-A, -B en -C in kaart brengen, geëxtraheerd uit RNA-sequentiegegevens van Flo-1-cellen (gegevens niet getoond).Peptidesequenties die consistent waren met de sequentiebepaling onthulden significante verschillen tussen HLA-A, -B en -C in gebieden waar verknoopte peptiden zich in HLA-A bevonden (Figuur S3).Bovendien hebben we geen eiwit-naar-eiwit-verknoping van HLA-B/C-moleculen met H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4-eiwitten waargenomen.Dit suggereert dat de gevonden eiwitinteractie tussen HLA-A, MDN1, LRCH1 en HMGA1 HLA-A-specifiek is.Bovendien toonde proteomische analyse van niet-verknoopte monsters (Tabel S4) aan dat HLA-A een hogere sequentiedekking heeft vergeleken met HLA-B of HLA-C.De voor HLA-A geïdentificeerde peptiden hadden een hoge intensiteit in zowel met IFNa behandelde als onbehandelde monsters.
Om ervoor te zorgen dat de hier geïdentificeerde interacties niet het gevolg waren van niet-specifieke verknoping van twee eiwitten in nauwe ruimtelijke nabijheid, bevestigden we verder twee nieuwe HLA-A-interagerende factoren door co-immunoprecipitatietests uit te voeren.HLA-A-interacties met endogeen MDN1 en H2B werden gedetecteerd in zowel met IFNa behandelde als onbehandelde Flo-1-cellen (Figuur 7, Figuur S4).We bevestigden dat HLA-A door H2B in de immunoprecipitaten werd gevangen en dat deze associatie het gevolg was van IFNa-behandeling, aangezien HLA-A afwezig was in de immunoprecipitaatmonsters van onbehandelde cellen (Figuur 7A).Onze gegevens suggereren echter dat IFNα de HLA-A-binding aan H2B en MDN1 op verschillende manieren reguleert.IFNα induceert associatie tussen H2B en HLA-A, maar vermindert de associatie met MDN1.We ontdekten dat MDN1 geassocieerd was met HLA-A in controles, en de toevoeging van IFNα verminderde deze interactie, onafhankelijk van MDN1-inductie door IFNα (Figuur 7B,C).Bovendien ving HLA-A-immunoprecipitatie H2B op in A549-cellen (Fig. S4), wat suggereert dat deze interactie onafhankelijk is van het celtype.Alles bij elkaar ondersteunen deze resultaten interferon-gemedieerde interacties van HLA-A met H2B en MDN1.
HLA-A zuivert samen H2B en MDN1.Representatieve endogene H2B (A) en MDN1 (B) immunoblots werden immunologisch neergeslagen uit met IFNa behandelde Flo-1-cellen en onderzocht op de aangegeven antilichamen.IgG van muis en konijn werd als negatieve controle gebruikt.(C) Relatieve hoeveelheden (input) van verschillende antigenen worden weergegeven door immunoblots die zijn getest tegen de aangegeven antilichamen, β-actine werd gebruikt als ladingscontrole.
De structurele eigenschappen van een van de door interferon geïnduceerde, zeer betrouwbare verknoopte netwerken, H2B-HLA-A-HMGA1, werden onderzocht.We gebruikten moleculaire dynamica-modellering als een alternatieve benadering om de conformationele dynamiek van de eiwitten die bij dit complex betrokken zijn te begrijpen (Figuur 8).Gevolgtrekkingen uit de CLMS-gegevens suggereren de mogelijkheid van verschillende conformaties van de H2B-, HLA-A- en HMGA1-eiwitten.Daarom werden de volgende potentiële complexen gemodelleerd in een oplosmiddelmedium: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A en H2B-HLA-A-HMGA1.Een eerste eiwit-eiwit-dockingscreen met behulp van het MOE-pakket (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) suggereerde mogelijke conformaties die tussen deze eiwitten verschillen (Fig. 8A).Visualisatie van het docking-eiwitcomplex onthulde verschillende interacties en mogelijke conformaties (Figuur 5A, 8).Eén mogelijke conformatie wordt dus weergegeven in Figuur 8A (met gelabelde verknopingen) en deze werd verder geëvalueerd met behulp van de MD-modelleringspijplijn.Bovendien benadrukt de binding van H2B of HMGA1 aan HLA-A de hogere affiniteit van H2B voor HLA-A (Fig. 8A).
Conformationele dynamiek van mogelijke netwerken tussen de H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A en H2B-HLA-A-HMGA1-complexen.(A) Linkerpaneel is een 2D-kaart (gegenereerd in SIM-XL-software) van intramoleculaire (rode) en intermoleculaire (blauwe) crosslinks (crosslink-cutoff ingesteld op 3,5).Bovendien worden de geïdentificeerde verknopingsresiduen gelabeld op de structuren van de H2B-, HLA-A- en HMGA1-eiwitten.De geassocieerde conformaties van deze eiwitten werden geëxtraheerd met behulp van de dockingpijplijn die in het MOE-pakket is geïmplementeerd.Het paneel linksonder toont de verschillende mogelijke conformaties van de H2B-HLA-A- en HMGA1-HLA-A-complexen met verschillende eiwit-eiwitbindingsaffiniteiten (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Standaardafwijking (RMSD) van atomaire posities (exclusief waterstofatomen) voor elke eiwitstructuur.(C) Intermoleculaire eiwit-eiwit-waterstofbindingsinteracties van verschillende gesimuleerde complexen, rekening houdend met specifieke interacties met een duur ≥ 10 ns.De grensafstand tussen donor en acceptor van de h-binding werd ingesteld op 3,5 Å en de grenshoek van de donor-H-acceptor werd ingesteld op ≥ 160°–180°.(D) Gelabelde residuen die HLA-A-eiwit-eiwit-interacties vormen met hun respectievelijke partners, verspreid over ≥ 20 ns, geëxtraheerd uit dummy HLA-A-H2B- en HLA-A-HMGA1-complexen.Eiwitstructuren vertegenwoordigen een gemiddelde structuur van 100 ns MDS.(E) Interacties tussen HLA-A-H2B- en HLA-A-HMGA1-complexen vergeleken met interacties gevolgd door H2B-HLA-simulatie over 100 ns op basis van de K- of S-interactieplaats tussen de twee peptiden.Complexen /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.De drempelwaarde voor de evaluatie van cross-links werd ingesteld op 3,0, en er werd rekening gehouden met specifieke interacties van MDS die ≥ 10 ns in beslag namen.Eiwitstructuren werden gevisualiseerd met behulp van BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, VS) en Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) pakketten.
De stabiliteit van HLA-A-moleculen in de loop van de tijd (standaardafwijking; RMSD of standaardafwijking; RMSF) gaf aan dat de aanwezigheid van H2B- of HMGA1-eiwitten in de complexen HLA-A stabiliseerde (Figuur 8B, Figuur S5).Het HMGA1-eiwit bindt stevig aan de B2M-plaats van HLA-A, waardoor de stabiliteit van de HLA-A-aminozuren in het HLA-A-HMGA1- of H2B-HLA-A-HMGA1-complex wordt geïnduceerd (Figuur 8B, Figuur S5).in het bijzonder bleken de HLA-residuen ~60-90 en ~180-210 minder flexibel te zijn in de aanwezigheid van H2B (FIG. 8B).H2B en HMGA1 vertoonden betere binding aan HLA-A in het H2B-HLA-A-HMGA1-complex vergeleken met HLA-A-binding aan H2B of HMGA1 alleen (Figuur 8C,D; Tabel S5).Residuen die betrokken zijn bij waterstofbinding (MD-gemodelleerde hoge bezettingsgraad ≥ 10 ns) vallen samen met CLMS-interactieplaatsen (K- of S-residuen) in het complex, wat suggereert dat de door CLMS geïdentificeerde interacties zeer betrouwbaar zijn.Betrouwbaarheid (Fig. 8E).Bij CLMS- en MD-modellering werd gevonden dat HLA-A-residuen tussen ongeveer 190-210 en ongeveer 200-220 aminozuren respectievelijk H2B en HMGA1 binden (FIG. 8E).
Eiwit-eiwit-interacties vormen dynamische structurele netwerken die de intracellulaire communicatie bemiddelen als reactie op bepaalde stimuli.Omdat veel proteomics-benaderingen veranderingen in het algehele steady-state-niveau van een eiwit detecteren, vereist de eiwit-eiwit-interactiedynamiek aanvullende hulpmiddelen om bindingsinterfaces vast te leggen, en CLMS is zo'n hulpmiddel.Het interferonsignaleringssysteem is een cytokinenetwerk dat cellen in staat stelt te reageren op een reeks omgevingspathogene en intrinsieke pathologische signalen, culminerend in de inductie van subsets van door interferon induceerbare eiwitten.We hebben CLMS toegepast om te bepalen of nieuwe eiwit-eiwitinteracties konden worden geïdentificeerd onder een panel van door interferon geïnduceerde eiwitten.Globale eiwitverknopingsanalyse in een op interferon reagerend Flo-1-celmodel werd gebruikt om eiwitcomplexen in te vangen.Extractie van tryptische peptiden uit niet-verknoopte en verknoopte cellen maakt het tellen van peptiden, padverrijking en verdeling van de peptidelengte met gedefinieerde LFQ-intensiteit mogelijk.Canonieke interferon-induceerbare eiwitten werden geïdentificeerd als een positieve interne controle, terwijl nieuwe intermoleculaire en intramoleculaire verknoopte adducten van canonieke interferon-induceerbare eiwitten zoals MX1, UP18, OAS3 en STAT1 werden waargenomen.Er zijn verschillende structurele kenmerken en interacties op functionele gebieden onderzocht.
Een interactie tussen HLA-A, MDN1 en H2B werd gedetecteerd door immunoblotting in Flo-1- en A549-cellen, behandeld en onbehandeld met IFNa.Onze resultaten benadrukken dat HLA-A op een IFNα-afhankelijke manier complexeert met H2B.Ons werk vertegenwoordigt een interessante weg voor verdere verkenning van de co-lokalisatie van deze twee complexen.Het zou ook interessant zijn om de CLMS-benadering uit te breiden naar een panel van cellijnen om celtype-onafhankelijke interferon-gemedieerde eiwitinteracties te identificeren.Ten slotte hebben we MD-modellering gebruikt als een alternatieve benadering om de conformationele dynamiek te begrijpen van eiwitten die betrokken zijn bij het H2BFS-HLA-A-HMGA1-complex, dat intramoleculaire en intermoleculaire overspraak volgde.Gevolgtrekkingen uit de CLMS-gegevens suggereren de mogelijkheid van verschillende conformaties van de H2BFS-, HLA-A- en HMGA1-eiwitten.De mogelijke verschillende conformaties tussen deze gekoppelde eiwitcomplexen brachten verschillende interacties aan het licht die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in de CLMS-dataset.Een van de belangrijkste sterke punten van onze methode is dat deze een gemakkelijke identificatie mogelijk maakt van op elkaar inwerkende zeer polymorfe genen zoals HLA. Het zal dus interessant zijn om interacties van HLA-haplotype-specifieke eiwitten te bestuderen die anders moeilijk te bestuderen zijn.Alles bij elkaar laten onze gegevens zien dat CLMS kan worden gebruikt om ons begrip van door interferon geïnduceerde signaalnetwerken uit te breiden en een basis te bieden voor het bestuderen van complexere intercellulaire systemen in de micro-omgeving van tumoren.
Flo-1-cellen werden verkregen van ATCC en bewaard in DMEM (Gibco) aangevuld met 1% penicilline/streptomycine (Invitrogen), 10% foetaal runderserum (Gibco) en bewaard bij 37°C en 5% CO2.Incubatie.Cellen werden gekweekt tot een confluentie van 70-80% voordat ze werden behandeld met IFNa14 (vervaardigd door Edinburgh Protein Production Facility).Alle andere chemicaliën en reagentia werden gekocht bij Sigma Aldrich, tenzij anders vermeld.
Flo-1-cellen werden gekweekt in platen met 6 putjes en de volgende dag werden de cellen behandeld met 10 ng/ml IFNa14 gedurende 24 uur tot een confluentie van ongeveer 80%.Cellen werden driemaal gewassen met PBS en geligeerd met vers bereid DSS (Thermo Fisher Scientific) (opgelost in DMSO) in PBS gedurende 5 minuten bij 37°C tot een eindconcentratie van 0,5 mM.De DSS-verknopingsreactie werd vervangen door PBS en de resterende DSS werd geblust door het toevoegen van 20 mM Tris (pH 8,0) in PBS gedurende 15 minuten bij 37°C.Cellen werden verzameld door schrapen en verzameld in buizen met lage binding (Axygen).
De celpellet werd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder af en toe schudden gelyseerd met 300 µl ureumlysebuffer (8 M ureum, 0,1 M Tris, pH 8,5).Alle centrifugatiestappen werden uitgevoerd bij 14.000 xg bij 8°C.Centrifugeer het lysaat gedurende 10 minuten en breng het supernatant over naar een nieuwe buis.De resterende heldere deeltjes werden gedurende 30 minuten of langer opgelost in 150 μl van de tweede lysebuffer (2 M ureum, 2% (w/v) SDS (natriumdodecylsulfaat)) totdat een homogene waterige oplossing werd verkregen.Het lysaat werd gedurende 20 minuten gecentrifugeerd en het supernatant werd gemengd met het in de voorgaande stap verkregen lysaat.Eiwitconcentraties werden beoordeeld met behulp van de Micro BCA-test (Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant voor microtiterplaatprocedures.De monsters werden snel ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80°C.
Ongeveer 100 μg oplosbaar verknoopt eiwit werd verwerkt met behulp van een aangepast filtratiemonstervoorbereidingsprotocol (FASP) zoals beschreven door Wisniewski et al.69 In het kort wordt het eiwit verknoopt met 200 µl ureumbuffer (8 M ureum in 0,1 M Tris, pH 8,5), gewerveld en gehalveerd.Alle centrifugatiestappen werden uitgevoerd bij 14.000 xg bij 25°C.De eerste helft van het verknoopte eiwitlysaat werd overgebracht naar een Microcon centrifugaal filterapparaat van 10 kDa, uitgerust met een Ultracel-10 membraan (Merck), gevolgd door 25 minuten centrifugeren op het filter.Voeg vervolgens de tweede helft van het eiwit toe aan het filter en herhaal dezelfde stappen.Eiwitwinning werd uitgevoerd door 100 μl 17 mM tris (2-carboxyethyl) fosfinehydrochloride (TCEP) toe te voegen aan ureumbuffer.De terugwinning werd gedurende 30 minuten bij 37°C op een thermomixer bij 600 rpm geroerd.Bovendien werd de kolom gecentrifugeerd en werd het gereduceerde verknoopte eiwit gealkyleerd met behulp van 100 μl 50 mM joodaceetamide in ureumbuffer.De alkyleringsreactie werd gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur uitgevoerd.Draai de kolom, was de kolomwanden driemaal met 100 µl ureumbuffer en centrifugeer vervolgens.Dezelfde bewerking werd driemaal uitgevoerd met 100 μl 100 mM ammoniumbicarbonaat.Vervang vóór trypsinisatie het verzamelbuisje door een nieuw exemplaar.Voeg spijsverteringsbuffer toe die 50 mM ammoniumbicarbonaat en 1 µl trypsine bevat, verdund in trypsinebuffer (Promega).De verhouding van trypsine tot eiwit werd op ongeveer 1:33 gehouden en de verteringsreacties werden overnacht bij 37°C in een vochtige kamer geïncubeerd.Het verknoopte peptide werd van het filter geëlueerd door 25 minuten centrifugeren.De peptidewinning werd verbeterd door 50 μl 0,5 M NaCl aan het filter toe te voegen, gevolgd door 25 minuten centrifugeren.
C18 Micro Spin-kolommen (Harvard Apparatus) werden gebruikt om verknoopte tryptische peptiden te ontzouten volgens het protocol beschreven door Bouchal et al.70 met kleine aanpassingen.In het kort werden C18-draaikolommen geactiveerd met drie wasbeurten met 0,1% mierenzuur (FA) in acetonitril (AcN) (Merck) en twee wasbeurten met 0,1% FA.De kolom werd gedurende 15 minuten gehydrateerd met 0,1% FA.Laad monsters in spinkolommen en was 3 keer met 0,1% FA.De ontzoute peptiden werden achtereenvolgens geëlueerd met een stapsgewijze gradiënt met behulp van 50%, 80% en 100% AcN in 0,1% FA.De monsters werden gedroogd in een SpeedVac Plus-concentrator (Eppendorf) totdat de resterende vloeistof volledig verdween.De geëlueerde peptiden werden opgelost in 100 μl 0,08% trifluorazijnzuur in 2,5% AcN en de concentraties werden gemeten op een NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Ongeveer 1 μg verknoopt peptide per monster werd in het LC-MS/MS-systeem geïnjecteerd.
Verknoopte peptiden werden gescheiden op een UltiMate 3000 RSLCnano LC-systeem (Thermo Scientific) verbonden met een Orbitrap Exploris 480 massaspectrometer (Thermo Scientific).Verknoopte peptiden werden verzameld op een 300 µm ID, 5 mm lange µ-pre-kolom C18-vangkolom gepakt met C18 PepMap100-sorbens en 5 µm PepMap-sorbens (Thermo Scientific).Laad de pompstroomset op 5 µl/min 0,08% trifluorazijnzuur opgelost in 2,5% AcN.Verknoopte peptiden werden gescheiden op een analytische kolom van gesmolten silica met een binnendiameter van 75 μm en een lengte van 150 mm, gevuld met een PepMap-sorbens van 2 μm (Thermo Scientific).Mobiele fasen A en B bestonden respectievelijk uit 0,1% FA in water en 0,1% FA in acetonitril.De gradiënt begint bij 2,5% B en neemt lineair toe tot 40% B gedurende 90 minuten, en vervolgens tot 90% B gedurende de volgende 2 minuten.De samenstelling van de mobiele fase werd 10 minuten op 90% B gehouden en vervolgens in 2 minuten lineair verlaagd tot 2,5% B.De kolom werd gedurende 8 minuten vóór de volgende cyclus geëquilibreerd bij 2,5% B.Verknoopte peptiden die uit de analytische kolom werden geëlueerd, werden geïoniseerd in een nano-elektrospray-ionisatiebron (NSI) en geïnjecteerd in een Exploris 480 massaspectrometer (Thermo Scientific).
De Orbitrap Exploris 480 massaspectrometer werkte in de positieve gegevenscorrelatiemodus.Er werd een volledige scan uitgevoerd in sectiemodus met een resolutie van 120.000 met bereikinstellingen van m/z 350 Th tot m/z 2000 Th.Het genormaliseerde AGC-doel was ingesteld op 300% met een maximale invoertijd van 50 ms.Voor peptiden is mono-isotopische piekdetectie vastgesteld.De beperkingsversoepelingsparameter wordt ingesteld op waar als er te weinig voorlopers worden gevonden.De minimale ionsterkte van de precursor werd ingesteld op 5,0e3 en ladingstoestanden van de precursor tot +8 werden in de experimenten opgenomen.
De cyclustijd tussen grote scans in de gegevenscorrelatiemodus was ingesteld op 2,5 seconden.Dynamische massa-uitsluiting werd ingesteld op 20 seconden na de eerste fragmentatie van het voorloperion.Het precursor-isolatievenster was ingesteld op 2 Th.Het type genormaliseerde botsingsenergie met een vaste botsingsenergiemodus werd gekozen in een gegevensafhankelijke MS/MS-scan.Botsingsenergie ingesteld op 30%.De Orbitrap-resolutie was vastgesteld op 15.000 en de AGC-doelstelling op 100%.De aangepaste maximale injectietijd is ingesteld op 60 milliseconden.
Voordat we het eiwit-eiwitnetwerk in verknoopte monsters volgden, verwerkten we de onbewerkte bestanden met behulp van het MaxQuant-pakket (versie 1.6.12.0) om traceerbare peptiden/eiwitten in de monsters te identificeren.Bovendien werden soortgelijke proteomische analyses uitgevoerd op niet-verknoopte Flo-1-monsters die al dan niet met IFNa waren behandeld.MS/MS-gegevens werden doorzocht in de menselijke database van UniProt (www.uniprot.org) (geüpload op 12 augustus 2020, bevat 75.093 vermeldingen) met behulp van de ingebouwde zoekmachine Andromeda27.Het onderzoek werd uitgevoerd zonder de specificiteit van het enzym en verschillende modificaties van deamidatie (N, Q) en oxidatie (M) aan te geven.De toleranties voor de precursormassa werden vastgesteld op 20 ppm en de productie-ionen op 0,02 Da.De initiële en maximale massaafwijking werd ingesteld op 10 ppm.De maximale massa van het peptide werd ingesteld op 4600 Da en de sequentie-overeenkomst werd ingesteld tussen 7 en 25 aminozuren (aa).Verdere statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van het Perseus-programma (versie 1.6.10.45).Het eiwitgehalte werd berekend door de spectrale intensiteit van het eiwit te normaliseren (LFQ-intensiteit; ongelabelde kwantificering) en de intensiteitswaarden werden omgezet naar Log2.Een hiërarchische clustering van eiwitten geïdentificeerd door hun peptide-intensiteit werd gebouwd met behulp van het pheatmap (v1.0.12) pakket in R (v 4.1.2).Pathway-verrijkingsanalyse werd uitgevoerd met behulp van de Reactome-pathway-database voor met IFNα behandelde eiwitten die meer dan vier keer geactiveerd waren vergeleken met onbehandelde monsters.
Identificatie van lysine (K) of serine (S) specifieke chemische verknopingen van eiwitcomplexen gevolgd door LC-MS / MS werd uitgevoerd met behulp van een spectroscopische identificatiemachine (SIM-XL) voor verknoopte peptiden (SIM-XL) .Ten eerste werden mogelijke interacties tussen interferon-geassocieerde (IFN) genen voor DNA-schaderesistentiesignatuur (IRDS) onderzocht met behulp van de IRDS-eiwitdataset beschreven in Padariya et al.28.Het screenen van alle aandoeningen en herhalingen van de gehele menselijke UniProt is rekenintensief, dus de gehele menselijke UniProt-database (www.uniprot.org) (gedownload op 12 augustus 2020, bevat 75.093 vermeldingen) tegen met IFNα behandelde herhalingen.Een van de filters voor interacties met veel vertrouwen.Deze verkregen interacties met een hoge significantie werden uitgebreid en getest in alle herhalingen en omstandigheden.
In SIM-XL werd DSS gebruikt voor de crosslinker (XL) en werden de XL-gewichtsverschuiving en modificatie-gewichtsverschuiving ingesteld op respectievelijk 138,06 en 156,07.De volgende verknopingsreactieplaatsen worden in beschouwing genomen: KK, KS en KN-TERM, zonder reporterionen.Zowel precursor- als fragment-ppm werden ingesteld op 20 en de Xrea-drempel werd ingesteld op 0,15.Trypsine werd als volledig specifiek beschouwd en er werd een hoogenergetische C-trap (HCD) fragmentatiemethode geïmplementeerd.De XCorr dynamische DB-reductiedrempel en het minimumaantal peptiden voor dynamische DB-reductie werden respectievelijk ingesteld op 2,5 en 2.Andere parameters zijn: waarschijnlijkheid van mono-isotoop en grenswaarde voor piekcoïncidentie, minimaal 4 AA-residuen per streng en maximale strenglading, en 3 maxima van gemiste splitsingen.De resulterende gestikte 2D-kaarten werden geanalyseerd in (SIM-XL) en de grafische weergave van xQuest28 werd gebruikt om de 2D-kaarten te bouwen.Eiwitverknopingen op eiwitstructuren worden gegeven in PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versie 2.0 Schrödinger, LLC).
Eiwitmodelstructuren werden gemaakt met behulp van de Phyre2-server (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) met behulp van de principes van homologiemodellering en implementatie van de "Hidden Markov-methode".Phyre2 genereert modelstructuren gebaseerd op sequentie-uitlijning met bekende eiwitstructuren.Voor H2BFS-, HLA-A-, HMGA1-, LRCH4- en MDN1-eiwitten werden matrijsstructuren 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 en 6i2665 gebruikt.Daarnaast werd ook gekeken naar de structuur van AlphaFold71 MX1, UBP18 en ROBO1.De eiwitstructuur werd gevisualiseerd met behulp van het BIOVIA Discovery Studio Visualizer-pakket (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, VS) en het Molecular Operating Environment-pakket (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).