ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex gelaste buis voor de chemische component van de chemische industrie, een tekort aan SPECC1L leidt tot verhoogde stabiliteit van gesplitste gewrichten en verminderd verlies van craniale neurale topcellen.

Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden wij u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.

ASTM A790 2507/2205 1,4462/1,4410 duplex gelaste buis voor chemische industrie

Liaocheng Sihe SS Materiaal Co., Ltd.is een toonaangevende fabrikant die gespecialiseerd is in roestvrijstalen naadloze buizen, blankgegloeide buizen, naadloze spiraalbuizen enz.Om klanten te faciliteren hebben wij ook buizen en pijpen gelast.Liaocheng Sihe SS Materiaal Co., Ltd.beschikt over de meest geavanceerde productie- en testapparatuur.Wij kunnen volledig aan uw eis voldoen.Volgens de norm hebben de door ons geproduceerde buizen altijd de juiste OD- en WT-tolerantie.De tolerantiecontrole is strikt in overeenstemming met de productienormen.Onze producten zijn altijd tevreden met klanten.Klanten die onze producten kochten, creëerden meer winst.
a) OD (buitendiameter): 3,18 mm tot 101,6 mm
b) GEWICHT (wanddikte): 0,5 mm tot 20 mm
c) Lengte: volgens de eis van de klant
d) Normen: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 enz
e) Procesmethode: ERW, EFW enz

Sliders met drie artikelen per dia.Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door de dia's te bladeren, of de knoppen op de schuifregelaar aan het einde om door elke dia te bladeren.
De craniale neurale topcellen (CNCC) werpen de embryonale neurale plooien af ​​en migreren naar de keelholtebogen, die de meeste middengezichtsstructuren vormen.CNCC-disfunctie speelt een belangrijke rol in de etiologie van orofaciale schisis, een veel voorkomende aangeboren afwijking.Er zijn heterozygote SPECC1L-mutaties gevonden bij patiënten met atypische en syndromale kloven.Hier rapporteren we verbeterde kleuring van canonieke adhesieve junctie (AJ) componenten, β-catenine en E-cadherine in gekweekte SPECC1L knockdown-cellen, en elektronenmicrofoto's tonen apicale-basale diffusie van AJ.Om de rol van SPECC1L in de craniofaciale morfogenese te begrijpen, hebben we een Specc1l-deficiënt muismodel gemaakt.Homozygote mutanten zijn embryonaal dodelijk en vertonen een verminderde neurale buissluiting en CNCC-laminering.AJ-eiwitkleuring is verhoogd in mutante neurale plooien.Dit AJ-defect komt overeen met een defect in de CNCC-delaminering, waardoor AJ-oplossing vereist is.Bovendien hebben Specc11-mutanten de PI3K-AKT-signalering verminderd en de apoptose verhoogd.In vitro was milde remming van PI3K-AKT-signalering in wildtype cellen voldoende om AJ-veranderingen te induceren.Belangrijk is dat AJ-veranderingen veroorzaakt door SPECC1L-knockdown kunnen worden teruggedraaid door activering van de PI3K-AKT-route.Alles bij elkaar suggereren deze gegevens dat SPECC1L, als een nieuwe regulator van PI3K-AKT-signalering en AJ-biologie, vereist is voor het sluiten van neurale buizen en CNCC-stratificatie.
Craniale neurale topcellen (CNCC's) lokaliseren zich in het dorsale neuroectoderm en maken zich los van het neuro-epithelium van de zich ontwikkelende neurale plooien via een proces waarbij de epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) betrokken is1,2,3.Premigrerende epitheliale CNCC's verstoren intercellulaire verbindingen en worden migrerende mesenchymale CNCC's die de eerste en tweede keelholtebogen vullen en het grootste deel van het craniofaciale kraakbeen vormen.Genen die de CNCC-functie reguleren, zijn dus vaak verstoord in de etiologie van craniofaciale aangeboren afwijkingen zoals orofaciale kloven, die alleen al in de VS meestal 1/800 geboorten treffen.Eén van de aangeboren misvormingen8.
Delaminatie van de CNCC valt samen met de sluiting van de voorste neurale buis tussen 8,5 en 9,5 dagen embryonale ontwikkeling bij muizen.Mutanten van een aantal orofaciale gespleten geassocieerde genen van muizen vertonen ook een vorm van neuraalbuisdefect, waaronder Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 en Pdgfrα12.De processen van neurale buissluiting en CNCC-stratificatie kunnen echter als onafhankelijk worden beschouwd, aangezien de Splotch-mutante muis (Pax3) defecten vertoont in de neurale buissluiting zonder enig effect op CNCC-stratificatie of migratie 13,14.Aanvullende muismodellen met defecten in CNCC-dissectie en neurale buissluiting zullen helpen de gemeenschappelijke moleculaire basis van deze twee processen af ​​te bakenen.
Isolatie van CNCC uit neuro-epitheliale cellen vereist het oplossen van adhesieve juncties (AJ's), die zijn samengesteld uit eiwitcomplexen die onder andere E-cadherine, β-catenine, α-E-catenine en α-actinine bevatten, geassocieerd met actinefilamenten 2 Onderzoek naar overexpressie E-cadherine in neurale plooien toonde een vermindering of vertraging van CNCC-delaminering.Omgekeerd resulteert de onderdrukking van E-cadherine in vroege stratificatie15,16.Veel van de factoren die EMT bemiddelen tijdens CNCC-stratificatie zijn transcriptiefactoren (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) en extracellulaire matrix (ECM) remodellerende eiwitten zoals matrix metalloproteïnasen (MMP's). CNCC's zijn echter directe cytoskelet-AJ-regulatoren. nog niet bekend.Het is bekend dat de PI3K-AKT-route de E-cadherine-niveaus antagoneert, voornamelijk uit kankeronderzoek17.Recente onderzoeken hebben aangetoond dat verlies van op PDGFα gebaseerde PI3K-AKT-signalering bij muizen leidt tot craniofaciale afwijkingen, waaronder een gespleten gehemelte en neuralebuisdefecten12.De relatie tussen de PI3K-AKT-route en AJ-stabiliteit na CNCC-stratificatie is echter onduidelijk.
We hebben SPECC1L eerder geïdentificeerd als het eerste mutante gen bij twee mensen met een ernstige kloof die zich uitstrekt van de mond tot het oog, bekend als schuine kloof (ObFC) of Tessier IV18-spleet.SPECC1L-mutaties zijn geïdentificeerd in twee multigenerationele families met het autosomaal dominante Opitz G/BBB-syndroom (OMIM #145410), waarin getroffen individuen hyperdistance en gespleten lip/gehemelte vertoonden19, en in één familie met Tibi-overdistance-syndroom (OMIM #145420)20 .meer dan de helft van de gevallen van het Opitz G/BBB-syndroom is X-gebonden (OMIM #300000) en wordt veroorzaakt door mutaties in het MID1-gen, dat codeert voor eiwit 22 van het met microtubuli geassocieerde celskelet.We veronderstellen dat SPECC1L, ook een eiwit geassocieerd met microtubuli en het actine-cytoskelet, de signalering kan mediëren die nodig is voor de hermodellering van het actine-cytoskelet tijdens celadhesie en migratie 18 .Door middel van in vitro en in vivo studies beschrijven we SPECC1L nu als een nieuwe regulator van AJ-stabiliteit via PI3K-AKT-signalering.Op cellulair niveau resulteerde SPECC1L-deficiëntie in een afname van het niveau van het pan-AKT-eiwit en een toename van de apicaal-basale dispersie van AJ, die werd geëlimineerd door chemische activering van de AKT-route.In vivo vertonen Specc11-deficiënte embryo's een verminderde sluiting van de neurale buis en verminderde CNCC-dissectie.SPECC1L functioneert dus in sterk gereguleerde op celadhesie gebaseerde signalering die vereist is voor de normale CNCC-functie tijdens gezichtsmorfogenese.
Om de rol van SPECC1L op cellulair niveau te karakteriseren, hebben we de eerder beschreven stabiele osteosarcoomcellijn U2OS met een tekort aan SPECC1L18 gebruikt.Deze stabiele U2OS-cellen met SPECC1L (kd) knockdown hadden een matige (60-70%) afname van de niveaus van SPECC1L-transcripten en eiwitten, samen met defecten in de migratie en reorganisatie van het actine-cytoskelet. Er is aangetoond dat SPECC1L tot mitotische defecten leidt 23 .Bij verdere karakterisering ontdekten we dat onze stabiele SPECC1L-kd-cellen de morfologie veranderden bij een zeer hoge mate van samenvloeiing (Figuur 1).Individuele controlecellen en kd-cellen bij lage samenvloeiing zagen er vergelijkbaar uit (Figuur 1A, D).24 uur na fusie behielden controlecellen hun kubusvormige vorm (Fig. 1B, E), terwijl SPECC1L-kd-cellen langer werden (Fig. 1C, F).De omvang van deze verandering in celvorm werd vastgelegd door in vivo live beeldvorming van controlecellen en kd-cellen (film 1).Om de rol van SPECC1L in confluente cellen te bepalen, hebben we eerst de expressie ervan onderzocht.We ontdekten dat de SPECC1L-eiwitniveaus toenamen na fusie (Figuur 1G), terwijl de SPECC1L-transcriptniveaus niet toenamen (Figuur 1H).Naarmate de celdichtheid toenam, accumuleerde het SPECC1L-eiwit zich bovendien aan de intercellulaire grenzen (Fig. 2A-E), met een patroon dat overlapt met dat van membraan-geassocieerd β-catenine (Fig. 2A'-E').Gegeven de associatie van SPECC1L met het actine-cytoskelet 18,23 veronderstelden we dat SPECC1L interageert met op actine gebaseerde adhesieve juncties (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF)-cellen worden langer bij hoge samenvloeiing (F) vergeleken met controle-U2OS-cellen (AC).Hier worden drie van de zes tijdstippen (T1, T3, T6) weergegeven die we hebben geselecteerd voor verschillende celdichtheden.(G) Western-blot-analyse die aantoont dat het SPECC1L-eiwit is gestabiliseerd bij een hoge mate van samenvloeiing vergeleken met een lage mate van samenvloeiing in controlecellen.Western blot van SPECC1L toont de verwachte band van 120 kDa en een band met een hoger molecuulgewicht, mogelijk post-translationeel gemodificeerd (*).Western blot-analyse werd onder dezelfde omstandigheden uitgevoerd voor lage en hoge samenvloeiing.Afbeeldingen die SPECC1L bij lage en hoge samenvloeiing tonen, werden uit dezelfde blot gehaald.Dezelfde vlek werd verwijderd en opnieuw onderzocht met P-actine-antilichaam.(H) Kwantitatieve RT-PCR-analyse toonde geen significante veranderingen in SPECC1L-transcriptniveaus.Foutbalken vertegenwoordigen SEM's van vier onafhankelijke experimenten.
(AE) We kozen zes tijdstippen (T1-T6) die een reeks celdichtheden vertegenwoordigen om de celvormanalyse en AJ-veranderingen in U2OS-cellen te normaliseren met SPECC1L knockdown (kd).De eerste vijf van deze tijdstippen omvatten afzonderlijke cellen (T1), 50-70% fusie van kleine celclusters (T2), fusie zonder hervormde kd-cellen (T3), hervormde kd-cellen (T4) en 24-uursveranderingen.in de posterieure vorm van kd (T5)-cellen.Het SPECC1L-eiwit was voornamelijk verspreid in het cytoplasma op T1 (A), maar de accumulatie ervan werd waargenomen aan de intercellulaire grenzen op daaropvolgende tijdstippen (B – E, pijlen).(FJ) β-catenine vertoont een vergelijkbare accumulatie op intercellulaire grenzen geassocieerd met het AJ-complex.(A'-E') SPECC1L en β-catenine vertonen overlappende kleuring aan celgrenzen bij hoge celdichtheid (pijlen).(F'-J') In SPECC1L-kd-cellen lijkt β-cateninekleuring normaal bij lage celdichtheid (F'-H'), maar wordt groter naarmate de celvorm verandert (I', J'; pijlen), wat aangeeft dat AJ zijn veranderd.Staven = 10 µm.
Vervolgens probeerden we het effect van SPECC1L-deficiëntie op AJ te bepalen.We gebruikten verschillende AJ-geassocieerde markers, waaronder de canonieke componenten F-actine, myosine IIb, β-catenine en E-cadherine.Actine-stressvezels namen toe in SPECC1L-kd-cellen zoals eerder beschreven (Fig. 3A,B) 18.Myosine IIb geassocieerd met actinefilamenten vertoonde in vitro een vergelijkbare toename in SPECC1L-kd-cellen (Fig. 3C,D).AJ-geassocieerde β-catenine bindt aan cadherine op het celmembraan en vertoont een normaal "honingraat" -expressiepatroon in controlecubocyten (Fig. 3E, G).Interessant is dat in vlakke beelden met behulp van confocale microscopie de kleuring van β-catenine (Fig. 3E, F) en E-cadherine (Fig. 3G, H) op het celmembraan van confluente SPECC1L-deficiënte cellen opvallende patronen van uitgebreide kleuring vertoonde.Deze uitbreiding van AJ-geassocieerde β-cateninekleuring in kd-cellen was het meest uitgesproken bij confluentie, maar leek vooraf te gaan aan veranderingen in celvorm (Fig. 2F-J, F'-J').Om de fysieke aard van deze uitgebreide AJ-kleuring te bepalen, onderzochten we celgrenzen op het apicale-basale oppervlak van SPECC1L-kd U2OS-cellen met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (Figuur 3I, J).In tegenstelling tot controlecellen (Fig. 3I), die afzonderlijke elektronendichte gebieden hadden die indicatief waren voor AJ (pijlen), vertoonden kd-cellen (Fig. 3J) grote, aaneengesloten gebieden met hoge elektronendichtheid die indicatief waren voor AJ langs het apicobasale vlak..Bovendien hebben we op dwarsdoorsneden uitgebreide celmembraanplooien in kd-cellen waargenomen (Fig. S1A, B), wat het uitgebreide patroon van β-catenine- en E-cadherine-kleuringsbanden verklaart (Fig. 3F, H).Ter ondersteuning van de rol van SPECC1L in AJs werd β-catenine co-immuungeprecipiteerd met SPECC1L in lysaten van samenvloeiende U2OS-cellen (Fig. 3K).Samen met uitgebreide immunokleuring voor AJ-markers was de TEM-analyse consistent met onze hypothese dat SPECC1L-deficiëntie de apicale-basale dichtheid en variantie van AJ verhoogt.
(AH) Verhoogde F-actinekleuring in kd-cellen 48 uur na de fusie (T6; A, B).Veranderde kleuring van myosine IIb geassocieerd met F-actine (C, D).Het vloeiende patroon van β-catenine- en E-cadherine-membraankleuring in controlecellen (E, G) werd verbeterd in SPECC1L-kd (F, H) -cellen.Staven = 10 µm.(I – J) Elektronenmicrofoto's observeren de apicaal-basale intercellulaire overgang.Controlecellen vertonen verschillende elektronendichte gebieden die kleverige kruispunten aangeven (I, pijlen).Daarentegen leek de gehele apicaal-basale overgang in SPECC1L-kd-cellen elektronendicht (J, pijlen), wat wijst op een verhoogde dichtheid en dispersie van adhesieve verbindingen.(K) β-catenine werd samen met SPECC1L geco-immunoprecipiteerd in confluente U2OS-cellysaten.Afbeelding genomen vanaf één plek die een van de vier onafhankelijke experimenten vertegenwoordigt.
Om de rol van SPECC1L bij craniofaciale morfogenese te begrijpen, hebben we een Specc1l-deficiënt muismodel gemaakt met behulp van twee onafhankelijke ES-trapcellijnen, DTM096 en RRH048 (BayGenomics, CA), die intron 1 vertegenwoordigen en Specc1l-transcripten werden vastgelegd op 15 (Fig. 1) .4A, figuur S2).De genomische locatie van de lokvectorinsert werd bepaald door sequencing van het hele genoom en bevestigd door PCR (Fig. S2).Beide gene trap-ontwerpen maakten ook in-frame fusie van de Specc11-lacZ-reporters na capture mogelijk.Daarom werd lacZ-expressie, bepaald door X-gal-kleuring, gebruikt als een indicator voor Specc11-expressie.Beide allelen vertoonden vergelijkbare lacZ-expressiepatronen, waarbij de DTM096-gene trap in intron 1 een sterkere expressie vertoonde dan RRH048 in intron 15 (niet getoond).Specc1l komt echter wijdverbreid tot uiting, met bijzonder sterke expressie in de neurale plooien bij E8.5 (Figuur 4B), in de neurale buis en gezichtsprocessen bij E9.5 en E10.5 (Figuur 4C,D), en in de zich ontwikkelende ledematen. op E10.5 en ogen (Figuur 4D).We rapporteerden eerder dat SPECC1L-expressie in de eerste keelholteboog op E10.5 aanwezig was in het epitheel en het onderliggende mesenchym , consistent met de CNCC-lijn.Om SPECC1L-expressie in CNCC te testen, hebben we E8.5 neurale plooien (Figuur 4E-J) en E9.5 schedelsecties (Figuur 4K-) uitgevoerd.Op E8.5 kleurde SPECC1L de neurale plooien intens (Fig. 4E, H), inclusief cellen gekleurd met NCC-markers (Fig. 4G, J).Bij E9.5 kleurde SPECC1L (Fig. 4K, N) sterk migrerende CNCC gekleurd met AP2A (Fig. 4L, M) of SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Schematische weergave van het Specc11-gen van de muis dat de lokvectorinsertie toont in ES DTM096 (intron 1) en RRH048 (intron 15) celklonen.(BD) lacZ-kleuring van heterozygote Specc1lDTM096-embryo's die Specc1l-expressie van E8.5 tot E10.5 vertegenwoordigen.NE = neuroectoderm, NF = neurale vouw, PA1 = eerste keelholteboog.(EP) SPECC1L-immunokleuring met NCC-markers AP2A en SOX10 in E8.5 (NF; EJ) neurale plooien en E9.5 (KP) schedelsecties.SPECC1L-kleuring werd algemeen waargenomen in neurale plooien E8.5 (E, H; pijlpunten), inclusief cellen gelabeld met AP2A (F, G; pijlpunten) en SOX10 (I, J; pijlpunten).Op E9.5 kleurde SPECC1L sterk migrerende CNCC's (K, N; pijlen) met het label AP2A (L, M; pijlen) en SOX10 (O, P; pijlen).
Kruising tussen heterozygote Specc1lDTM096/+ en Specc1lRRH048/+ muizen toont aan dat de twee gene trap-allelen niet complementair zijn en dat samengestelde heterozygoten en embryonale homozygoten voor beide gene trap-allelen embryonaal dodelijk zijn (Tabel S1).Mendeliaanse ratio's wezen op een afname van het overlevingspercentage van heterozygoten bij de geboorte (verwacht 1,34 versus 2,0).We constateerden een lage perinatale sterfte onder heterozygoten, sommigen hadden craniofaciale afwijkingen (Fig. S3).De lage penetrantie van deze perinatale craniofaciale fenotypes maakt het echter moeilijk om hun onderliggende pathofysiologische mechanismen te bestuderen.Daarom concentreerden we ons op het embryonale dodelijke fenotype van homozygote Specc11-mutanten.
De meeste samengestelde heterozygote of homozygote Specc1lDTM096/RRH048-mutante embryo's ontwikkelden zich niet na E9.5-10.5 (Fig. 5A-D), en de neurale buis sloot niet anterieur (Fig. 5B, D) en sloot soms posterieur (niet getoond) ..Dit sluitingsdefect van de craniale neurale buis was geassocieerd met het feit dat de meerderheid van de CNCC-gemarkeerde DLX2 in de neurale plooien achterbleef op E10.5, wat aangeeft dat er geen dissectie was (Figuur 5A'-D').Om te bepalen of de totale omvang van CNCC ook was verkleind, hebben we CNCC-lijnen met GFP in onze gene trap-lijnen getagd met Wnt1-Cre en ROSAmTmG.We streamen gesorteerde GFP+ NCC en GFP- (RFP+) niet-NCC van hele embryo's.Op E9.5 veranderde het aandeel van stroomgesorteerde GFP-gelabelde CNCC's niet significant tussen WT en mutante embryo's (niet getoond), wat duidt op normale CNCC-specificatie.Daarom veronderstelden we dat resterende Wnt1-Cre- en DLX2-kleuring in blootgestelde neurale plooien (Figuur 5B') te wijten was aan defecte CNCC-laagvorming, mogelijk als gevolg van verhoogde dichtheid of dispersie van AJ-cellen, zoals te zien in SPECC1L-kd-cellen.We gebruikten de NCC-markers SOX10, AP2A en DLX2 om de aanwezigheid van CNCC in de neurale vouw te bevestigen (Figuur 5E-R).Op E8.5 werd neurale vouwkleuring voor alle drie de NCC-markers waargenomen in secties van WT (Fig. 5E, G, I) en Specc1l-mutant (Fig. 5F, H, J).Op E9.5, terwijl NCC-markers migrerend NCC in WT-secties kleurden (Fig. 5M, O, Q), werd resterende NCC-kleuring waargenomen in blootgestelde neurale plooien van Specc1l-mutante embryo's (Fig. 5N, P, R).Omdat SOX10 en DLX2 migrerende CNCC's markeren, suggereert dit resultaat dat SPECC1L-deficiënte CNCC's post-migrerende specificatie bereiken, maar er niet in slagen te migreren vanuit neurale plooien.
Specc11-deficiëntie leidt tot defecte sluiting van de neurale buis, delaminatie van craniale neurale topcellen en AJ's.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo met migrerende craniale neurale topcellen (CNCC) gelabeld met Wnt1-Cre (A').Specc11-mutante embryo's vertonen daarentegen open neurale vouwen (B), pijlpunten) en CNCC's die niet zijn gemigreerd (B', pijlpunten).(C, D') Helderveldbeelden (C, D') en immunokleuring (C', D') van de CNCC-marker DLX2 van E10.5 WT-embryo's (C, C') en Specc1l (D, D').In WT E10.5-embryo's koloniseert DLX2-positieve CNCC de kieuwbogen (C', pijlen), terwijl bij mutanten opvallende kleuring aanhoudt in de open neurale plooien (D', pijlen) en in de eerste keelholtebogen (D', pijlen). pijlen).) met enige kleuring (pijlen) die wijzen op slechte delaminatie en migratie van CNCC.ER) Secties van WT- en Specc1l-mutante embryo's in de stadia E8.5 (E – L) en E9.5 (M – R) werden gelabeld met NCC-markers SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) en DLX2 (I, J, Q, R).Op E8.5 werd NCC-kleuring waargenomen in wildtype neurale vouw (NF) en mutantsecties.Co-kleuring van SOX10 en β-catenine in E8.5 WT (K) en mutant (L) onthulde verhoogde β-catenine-kleuring op celgrenzen in de neurale plooien.Op E9.5 werd wildtype kleuring van migrerende CNCC's (M, O, Q) waargenomen, terwijl bij mutanten niet-gestratificeerde CNCC's open neurale plooien kleurden (N, P, R).(S – Z) In vivo AJ-labelingsanalyse in coronale secties van WT- en Specc11DTM096 / RRH048-embryo's met de E9.5-mutatie.In de rechterbovenhoek wordt een benaderend doorsnedevlak weergegeven.In secties van mutante weefsels werd een verhoogde kleuring van F-actine (S, T) en myosine IIb (U, V) waargenomen.Vergelijkbaar met de in vitro resultaten in Fig. 3 werd in mutante embryo's verbeterde membraankleuring voor β-catenine (W, X) en E-cadherine (Y, Z) waargenomen.(AA-BB) Een elektronenmicrofoto van een deel van een wildtype embryo dat voorbij de grens van de apicaal-basale cel kijkt, toont een duidelijk elektronendicht gebied dat indicatief is voor adhesieve verbindingen (AA, pijlen).In secties van Specc11-mutante embryo's (BB, pijlen) is de gehele apicobasale overgang daarentegen elektronendicht, wat wijst op een verhoogde dichtheid en spreiding van adhesieve verbindingen.
Om onze hypothese te testen dat verminderde gelaagdheid het gevolg is van veranderde AJ, onderzochten we AJ-labeling in blootgestelde neurale plooien van Specc1l-mutante embryo's (Fig. 5S-Z).We hebben een toename van actine-stressvezels waargenomen (Fig. 5S, T) en een daarmee gepaard gaande verhoogde lokalisatie van myosine IIB-kleuring op actinevezels (Fig. 5U, V).Belangrijk is dat we een verhoogde kleuring van β-catenine (Fig. 5W, X) en E-cadherine (Fig. 5Y, Z) aan intercellulaire grenzen waarnamen.We onderzochten ook β-cateninekleuring van NCC in de neurale plooien van E8.5-embryo's (Fig. 5K, L).β-cateninekleuring leek sterker te zijn in Specc1l-mutante neurale plooien (Fig. 5L en K), wat suggereert dat AJ-veranderingen waren begonnen.In elektronenmicrofoto's van schedelcoupes van E9.5-embryo's hebben we opnieuw verhoogde diffuse elektronendichte kleuring waargenomen in Specc1l-mutante embryo's vergeleken met WT (Fig. 5AA, BB en S1E-H).Alles bij elkaar ondersteunen deze resultaten onze in vitro resultaten in SPECC1L-kd U2OS-cellen en suggereren dat afwijkende AJ-kleuring voorafgaat aan CNCC-stratificatie in onze mutante embryo's.
Gegeven de bekende antagonistische relatie tussen AKT-activiteit en E-cadherine-stabiliteit,17,28 veronderstelden we de betrokkenheid van PI3K-AKT-signalering.Bovendien hebben we subepidermale blaren waargenomen in sommige van onze mutante embryo's die aan de dodelijkheid ontsnapten (<5%) bij E9.5-10.5 en zich in plaats daarvan rond E13.5 vestigden (Fig. S3).Subepidermale blaasjes zijn een kenmerk van verminderde PI3K-AKT-signalering op basis van PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) rapporteerden dat verstoring van op PDGFRα gebaseerde PI3K-activering in PdgfraPI3K/PI3K-mutante embryo's resulteert in subepidermale blaasjes, neuralebuisdefecten en gespleten gehemelte-fenotypes.De niveaus van pan-AKT en actief gefosforyleerd Ser473-AKT werden in vivo in Speccl-mutante weefsels verlaagd tot embryonale arrestatie van E9.5 (Fig. 6A-D).De afname van de niveaus van gefosforyleerd Ser473-AKT kan volledig te wijten zijn aan de afname van de niveaus van pan-AKT in vivo (FIG. 6E) en in vitro (FIG. 6F).Een in vitro afname werd alleen waargenomen wanneer U2OS-cellen sterk samenvloeiden met veranderingen in celvorm en AJ-dichtheid (Figuur 6D).Onze gegevens suggereren dus dat SPECC1L een nieuwe positieve regulator is van PI3K-AKT-signalering bij craniofaciale morfogenese.
(A-E) E8.5 (A,B) en E9.5 (C,D) schedelsecties of E9.5-lysaten van Specc1l-mutante embryo's (E) die niveaus van actief gefosforyleerde S473-AKT en pan-AKT-eiwitreductie tonen , vergeleken met controle WT.Western-blotting werd onder dezelfde omstandigheden uitgevoerd op wildtype lysaten en mutante lysaten.De voor SPECC1L getoonde afbeeldingen zijn afkomstig van één vlek.Dezelfde vlek werd verwijderd en opnieuw onderzocht met anti-pan-ACT- en β-actine-antilichamen.Pan-AKT-niveaus in E8.5-neurale plooien (A, B) en niveaus van gefosforyleerd S473-AKT in E9.5-schedelcoupes waren significant verlaagd.(F) Pan-AKT-niveaus werden op vergelijkbare wijze verlaagd in lysaten van SPECC1L-kd U2OS-cellen geoogst bij hoge confluentie.Foutbalken vertegenwoordigen SEM's van drie onafhankelijke Western-blot-kwantificeringen.(GJ) Secties van WT-embryo's op E9.5 gekleurd met respectievelijk KI67 en gesplitst caspase 3, waarbij celproliferatie (G, G') en weinig apoptotische activiteit (H, H') worden getoond.Specc11-mutante embryo's vertonen een vergelijkbare celproliferatie (I), maar het aantal cellen dat apoptose ondergaat is aanzienlijk toegenomen (J).
Vervolgens onderzochten we markers van proliferatie en apoptose.We hebben geen enkel verschil waargenomen in de proliferatie van E9.5-embryo's (Fig. 6E, G vergeleken met I) met een proliferatie-index van 82,5% voor WT-mutanten en 86,5% voor Specc1l-mutanten gemeten door KI67-kleuring (p <0,56, Fisher's exacte proef).Op dezelfde manier hebben we geen enkel verschil waargenomen in apoptose gemeten door kleuring voor gesplitst caspase 3 in neurale plooien bij E8.5 tot het stoppen van het embryo (niet getoond) (niet getoond).Daarentegen was apoptose significant verhoogd in alle E9.5-mutante embryo's (Fig. 6F, H en J).Deze algehele toename van apoptose komt overeen met verminderde PI3K-AKT-signalering en vroege embryonale letaliteit29,30,31.
Om vervolgens een causale rol voor PI3K-AKT-signalering in AJ-veranderingen in onze kd-cellen te bevestigen, hebben we de route in controle- en kd-cellen chemisch gewijzigd (Figuur 7A-F).We gebruikten als marker het fenotype van celvormverandering waargenomen in samenvloeiende SPECC1L-kd-cellen, dat we kwantificeerden met behulp van de verhouding van de langste dimensie (lengte) tot de overeenkomstige verticale dimensie (breedte).Een verhouding van 1 wordt verwacht voor relatief ronde of kubusvormige cellen (Figuur 7G).Naast de celvorm bevestigden we ook het effect op AJ door β-cateninekleuring (Fig. 7A'-F').Remming van de PI3K-AKT-route met behulp van wortmannine was voldoende om de celvorm in controlecellen (Figuur 7A, C) en AJ (Figuur 7A') te veranderen.PI3K-AKT-activator SC-79 had geen invloed op de celvorm (FIG. 7A, E) of AJ-expansie (FIG. 7A') in controlecellen.In SPECC1L-kd-cellen resulteerde verdere onderdrukking van de PI3K-AKT-route in verhoogde apoptose (Fig. 7B, D) en een duidelijke toename in β-cateninekleuring (Fig. 7B'), consistent met onze in vivo zware mutanten.Belangrijk is dat activering van de PI3K-AKT-route de celvorm (Figuur 7B,F) en AJ-fenotypes (Figuur 7B”) aanzienlijk verbeterde.Veranderingen in celvorm werden gekwantificeerd als celrondheidsverhouding (CCR) en vergeleken op significantie zoals hierboven beschreven (Figuur 7G).In controlecellen (Fig. 7G, CCR = 1,56) was behandeling met wortmannine inderdaad voldoende om de celvorm significant te veranderen (Fig. 7G, CCR = 3,61, p <2,4 x 10-9) in een mate vergelijkbaar met die waargenomen in SPECC1L.-kd-cellen (Fig. 7G, CCR = 3,46).Wortmanninebehandeling van SPECC1L-kd-cellen (Fig. 7G, CCR = 3,60, verwaarloosbaar) was niet significanter dan onbehandelde kd-cellen (Fig. 7G, CCR = 3,46, verwaarloosbaar) of met wortmannine behandelde controlecellen (Fig. 7G)., CCR = 3,46, verwaarloosbaar) heeft bovendien invloed op de celverlenging (7G, CCR = 3,61, verwaarloosbaar).Het belangrijkste was dat de SC-79 AKT-activator het langwerpige fenotype van SPECC1L-kd-cellen herstelde (Fig. 7G, CCR = 1,74, p <6,2 x 10-12).Deze resultaten bevestigen dat SPECC1L de PI3K-AKT-signalering reguleert en suggereren dat een matige afname van SPECC1L de celadhesie beïnvloedt, terwijl een sterke afname tot apoptose leidt (Fig. 8).
(A – F') Controlecellen (A, C, E) en SPECC1L-kd (B, D, F) cellen behandeld met PI3K-AKT-pathway-remmer wortmannine (C, D) of SC-79-activator (E, F) Behandeling Onbehandelde controlecellen zijn kubusvormig (A) met normale β-cat-cellulaire kleuring (A'), terwijl kd-cellen langwerpig zijn (B) met verhoogde β-cat-kleuring (B').Na onderdrukking van de PI3K-AKT-route verlengden controlecellen (C) met β-cat-expansie (C'), terwijl kd-cellen apoptose begonnen te ondergaan (D), vergelijkbaar met onze sterk gemuteerde embryo's en extreem verbeterde β-cat vertoonden.kleuring (D').Na activering van de PI3K-AKT-route bleven de controlecellen kubusvormig (E) en vertoonden ze een normale β-cat (E')-kleuring, terwijl kd-cellen een significant verbeterde celvorm (F) en β-cat (F')-kleuring vertoonden, wat aangeeft (G) De mate van celvormverandering in (AF) werd gekwantificeerd met behulp van de celrondheidsverhouding (CCR) van de langste dimensie (lengte) en de overeenkomstige verticale dimensie (breedte) met behulp van MetaMorph-software.Onbehandelde (NT) SPECC1L-kd-cellen (CCR = 3,46) waren significant langer dan controlecellen (CCR = 1,56, p <6,1 x 10–13).De remming door Wort van de PI3K-AKT-route in controlecellen was voldoende om een ​​vergelijkbare verlenging van de celvorm te veroorzaken (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Op dezelfde manier herstelde AKT-activering door SC-79 in SPECC1L-kd-cellen de celverlenging tot controleniveaus (CCR = 1,74, p <6,2 x 10–12).Wortmanninebehandeling van SPECC1L-kd-cellen resulteerde in verhoogde apoptose maar geen verdere toename in celvormverandering (CCR=3,60) vergeleken met onbehandelde kd (CCR=3,46, ns) of met wortmannine behandelde controlecellen (3,61) waargenomen in .ns = maakt niet uit.+/- SEM-metingen voor 50 cellen worden getoond.Statistische verschillen werden berekend met behulp van Student's t-test.
(A) Schematische weergave van remming en activering van de PI3K-AKT-route resulterend in respectievelijk AJ-veranderingen en redding.(B) Voorgesteld model voor AKT-eiwitstabilisatie door SPECC1L.
Premigrerende CNCC's vereisen dat AJ-lyse zich scheidt van de neuro-epitheliale cellen van de voorste neurale vouw1,15,32.Toegenomen kleuring van AJ-componenten en verlies van de apicaal-basale AJ-asymmetrische verdeling in SPECC1L-deficiënte cellen, zowel in vitro als in vivo, gecombineerd met de fysieke nabijheid van SPECC1L tot β-catenine, suggereren dat SPECC1L functioneert om de lokale AJ-stabiliteit gedurende langere tijd goed te behouden. organisatie spieren.actine cytoskelet.De associatie van SPECC1L met het actine-cytoskelet en β-catenine en de toename van het aantal gecondenseerde actinefilamenten bij afwezigheid van SPECC1L is consistent met de waargenomen toename in AJ-dichtheid.Een andere mogelijkheid is dat een verhoogd aantal actinevezels in SPECC1L-deficiënte cellen leidt tot een verandering in de intercellulaire spanning.Omdat cellulaire stress de dynamiek van AJ 33 beïnvloedt, kunnen spanningsveranderingen resulteren in meer diffuse AJ 34.Elke wijziging heeft dus invloed op de CNCC-lagen.
Wnt1 komt tot expressie in de vroege neurale plooien die aanleiding geven tot neurale topcellen.Het traceren van de Wnt1-cre-afstamming markeert dus zowel pre- als migrerende NCC35.Wnt1 markeert echter ook dorsale hersenweefselklonen die ook afkomstig zijn van vroege neurale plooien 35,36, waardoor het waarschijnlijk is dat onze kleuring van E9.5-mutanten voor Wnt1-markers in open neurale plooien geen CNCC is.Onze positieve kleuring voor de NCC-markers AP2A en SOX10 bevestigde dat de blootgestelde neurale plooien van Specc11-mutante embryo's inderdaad CNCC bevatten.Omdat AP2A en SOX10 markers zijn van vroeg migrerende NCC, gaf positieve kleuring bovendien aan dat deze cellen post-migrerende CNCC zijn die niet kunnen worden gestratificeerd met E9.5.
Onze gegevens suggereren dat moleculaire regulatie van AJ door SPECC1L wordt gemedieerd door PI3K-AKT-signalering.AKT-signalering is verminderd in SPECC1L-deficiënte cellen en weefsels.Bevindingen door Fantauzzo et al.ondersteunen een directe rol voor PI3K-AKT-signalering in craniofaciale morfogenese.(2014) toonden aan dat het gebrek aan activering van op PDGFRα gebaseerde PI3K-AKT-signalering leidt tot een gespleten gehemelte-fenotype.We laten ook zien dat remming van de PI3K-AKT-route voldoende is om AJ en celvorm in U2OS-cellen te veranderen.In overeenstemming met onze bevindingen concluderen Cain et al.toonden aan dat downregulatie van de PI3K α110-subeenheid in endotheelcellen resulteert in een vergelijkbare toename in pericellulaire β-cateninekleuring, ook wel een toename van de "connectiviteitsindex" genoemd.In endotheelcellen waarvan de actinefilamenten al sterk georganiseerd zijn, resulteert onderdrukking van de PI3K-AKT-route echter in een losse celvorm.SPECC1L-kd U2OS-cellen vertoonden daarentegen een langwerpige celvorm.Dit verschil kan celtypespecifiek zijn.Terwijl onderdrukking van PI3K-AKT-signalering permanent het actine-cytoskelet beïnvloedt, wordt het effect op de celvorm bepaald door veranderingen in spanning veroorzaakt door veranderingen in de dichtheid en organisatie van centrale actinevezels.In U2OS-cellen gebruikten we alleen veranderingen in de celvorm als marker voor SPECC1L-deficiënte AJ-verandering en -herstel.Concluderend veronderstellen we dat remming van de AKT-route bij SPECC1L-deficiëntie de AJ-stabiliteit verhoogt en delaminatie bij CNCC vermindert.
Interessant genoeg werden pan-AKT-niveaus in vitro en in vivo verlaagd naast gefosforyleerde 473-AKT-niveaus in afwezigheid van SPECC1L, hetgeen suggereert dat regulering van PI3K-AKT-signalering op het niveau van AKT-eiwitstabiliteit of -omzet plaatsvindt.De SPECC1L- en MID1-genen, beide geassocieerd met het Opitz/GBBB-syndroom, coderen voor eiwitten die microtubuli stabiliseren 18,22.Het mechanisme waarmee SPECC1L en MID1 de stabilisatie van microtubuli bemiddelen, is nog niet volledig begrepen.In het geval van SPECC1L omvat deze stabilisatie verbeterde acetylering van een subset van microtubuli 18.Het is mogelijk dat SPECC1L een soortgelijk mechanisme gebruikt om andere eiwitten zoals AKT te stabiliseren.Er is aangetoond dat acetylering van lysineresiduen in het AKT-eiwit leidt tot een afname van membraanlokalisatie en fosforylatie38.Bovendien is ubiquitinatie van de K63-keten op hetzelfde lysineresidu op AKT vereist voor de membraanlokalisatie en activering ervan39,40.Van de verschillende factoren die interageren met SPECC1L-eiwitten die zijn geïdentificeerd in verschillende twee-hybride screens met hoge doorvoer van gist, zijn er vier – CCDC841, ECM2942, APC en UBE2I43 – betrokken bij eiwitomzet of stabiliteit via ubiquitinatie of sumoylatie.SPECC1L kan betrokken zijn bij post-translationele modificatie van AKT-lysineresiduen, waardoor de AKT-stabiliteit wordt beïnvloed.De cruciale rol van SPECC1L in de lokalisatie en stabiliteit van het AKT-eiwit moet echter nog worden opgehelderd.
Ernstige defecten in SPECC1L-expressie in vivo resulteerden in verhoogde AJ-markerkleuring en defecte CNCC-overlay, evenals verhoogde apoptose en vroege embryonale letaliteit.Eerdere rapporten hebben aangetoond dat muismutanten met verhoogde niveaus van apoptose geassocieerd zijn met neurale buisdefecten 44,45,46,47 en craniofaciale defecten48.Er is gesuggereerd dat overmatige celdood in de neurale plooien of keelholtebogen kan resulteren in een onvoldoende aantal cellen dat nodig is voor een goede morfogenetische beweging 48,49,50.Daarentegen vertoonden onze SPECC1L-deficiënte cellijnen met matig verminderde SPECC1L-expressie alleen AJ-veranderingen zonder bewijs van verhoogde celdood.Chemische remming van de PI3K-AKT-route in deze Kd-cellen resulteerde echter wel in verhoogde apoptose.Een gematigde afname van SPECC1L-expressie of -functie zorgt dus voor celoverleving.Dit komt overeen met de waarneming dat zeldzame Specc11-mutante embryo's die aan arrestatie in st.E9.5 zijn – misschien als gevolg van de verminderde efficiëntie van het vangen van genen – in staat hun neurale buizen te sluiten en later in de ontwikkeling te stoppen, vaak met craniofaciale defecten (Fig. S3).Ook consistent hiermee is het zeldzame voorkomen van heterozygote Specc1l-embryo’s met craniofaciale afwijkingen – waarschijnlijk als gevolg van de verhoogde efficiëntie van het vangen van genen – evenals de bevinding bij zebravissen waarbij een van de twee SPECC1L-orthologen (specc1lb) late embryonale fenotypes veroorzaakt, waaronder verlies van onderkaken en bilaterale kloven51.Derhalve kunnen heterozygote SPECC1L-verlies-van-functie-mutaties geïdentificeerd bij menselijke patiënten kleine stoornissen in de SPECC1L-functie veroorzaken tijdens craniofaciale morfogenese, voldoende om hun orofaciale kloven te verklaren.Op SPECC1L gebaseerde regulatie van intercellulaire contacten kan ook een rol spelen bij palatogenese en fusie van de keelholtebogen.Verder onderzoek naar de functie van SPECC1L zal de rol van tijdelijke intercellulaire contacten bij CNCC tijdens het sluiten van de neurale buis in de motiliteit van neuro-epitheliale cellen en craniofaciale morfogenese helpen ophelderen.
U2OS osteosarcoomcontrole en SPECC1L-kd-cellen zijn eerder beschreven (Saadi et al., 2011).Antilichamen tegen SPECC1L zijn ook eerder gekarakteriseerd (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenine-antilichamen (konijn; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (muis; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosine IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO)), E-cadherine (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Californië), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), gesplitste caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) en β-actine (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) werd gebruikt zoals beschreven..Actinefilamenten werden gekleurd met Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS-controlecellen en SPECC1L-kd-cellen werden gekweekt in standaard DMEM met hoog glucosegehalte aangevuld met 10% foetaal runderserum (Life Technologies, Carlsbad, CA).Voor AJ-veranderingen werden 2 x 105 cellen uitgezaaid op glas behandeld met 0,1% varkensgelatine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en geobserveerd op veranderingen in celvorm.Cellen werden verzameld op verschillende aangegeven tijdstippen: 4 uur na het zaaien (t = 1), 24 uur na het zaaien (t = 2), samenvloeiing zonder verandering in celvorm (t = 3), verandering in celvorm (t = 4) , 24 uur na celvormverandering (t = 5) en 48 uur na celvormverandering (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Om de PI3K-AKT-route te moduleren, werden cellen in de aangegeven concentraties gekweekt met de PI3K-AKT-remmer wortmannine (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) of SC-79-activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Het medium dat de chemicaliën bevatte, werd dagelijks ververst.
Frame-voor-frame opnames werden gemaakt op live controle- en KD-cellen onder normale kweekomstandigheden, en fasecontrastbeelden werden gedurende 7 dagen elke 10 minuten verzameld.Beelden werden verkregen met behulp van een computergestuurde Leica DM IRB omgekeerde microscoop uitgerust met een mechanische tafel en een 10 x N-PLAN-objectief aangesloten op een QImaging Retiga-SRV-camera.Tijdens beeldvorming werden celculturen op 37°C gehouden in een vochtige atmosfeer met 5% CO2.
Twee gene trap ES-cellijnen DTM096 en RRH048 van het Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) werden gebruikt om Specc11-deficiënte muislijnen te genereren, genaamd Specc1lgtDTM096 en Specc1lgtRRH046.In het kort werden 129/REJ ES-cellen geïnjecteerd in C57BL6-blastocysten.De resulterende chimere mannelijke muizen werden gekruist met vrouwelijke C57BL6-muizen om nakomelingen met agouti-vachtkleuring te identificeren.De aanwezigheid van gene trap-vectorinserts werd gebruikt om heterozygoten te identificeren.Muizen werden op een gemengde achtergrond van 129/REJ;C57BL6 gehouden.De locatie van de insertieplaats van de genetische valvector werd bevestigd door RT-PCR, genoomsequencing en genetische complementatie (aanvullende figuur 1).Om de CNCC-afstamming van dubbel heterozygote Specc1lGT-muizen te traceren, werden ROSAmTmG (#007576) en Wnt1-Cre (#003829) muizen (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) gekruist om het ROSAmTmG- en Wnt1-Cre-allel te produceren in Specc1l-mutante embryo's.Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het University of Kansas Medical Center.
Embryo's werden gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd in (1% formaldehyde, 0,2% glutaaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA).Na fixatie in X-gal kleuroplossing (5 mM kaliumferricyanide, 5 mM kaliumferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0,01% natriumdeoxycholaat, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) werd de kleurontwikkeling uitgevoerd bij 37°C .°C binnen 1-6 uur.Embryo's werden achteraf gefixeerd in 4% PFA en gevisualiseerd.
Voor Western-blotting werden cellen gelyseerd in passieve lysisbuffer (Promega, Fitchburg, WI) aangevuld met een mengsel van HALT-proteaseremmers (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysaten werden verwerkt op 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX kant-en-klare gels (Bio-Rad, Hercules, CA) en overgebracht naar Immobilon PVDF-membranen (EMD Millipore, Billerica, MA).De membranen werden geblokkeerd in 5% melk in PBS met 0,1% Tween.Antilichamen werden overnacht bij 4°C of gedurende één uur bij kamertemperatuur geïncubeerd.Femto SuperSignal West ECL-reagens (Thermo Scientific, Waltham, MA) werd gebruikt voor signaalgeneratie.Voor immunokleuring werden de embryo's overnacht gefixeerd in 4% PFA/PBS en gecryopreserveerd.Cryosecties van weefsel werden geblokkeerd in PBS met 1% normaal geitenserum (Thermo Scientific, Waltham, MA) en 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en vervolgens bij 4°C in een incubator geïncubeerd tijdens de nacht.met anti-antilichaam en fluorescerend secundair antilichaam (1:1000) gedurende 1 uur bij 4°C.Gekleurde secties werden in ProLong goudmedium (Thermo Scientific, Waltham MA) geplaatst en vlakke beelden werden verkregen met behulp van een Leica TCS SPE confocale microscoop.Elke immunokleuring werd uitgevoerd als drie onafhankelijke experimenten op cirossecties van ten minste twee mutante embryo's.Een representatief experiment wordt getoond.
Cellen werden geïncubeerd in gemodificeerde RIPA-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA en HALT-proteaseremmer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) In het kort werden lysaten voorgezuiverd met magnetische proteïne G-korrels (Life Technologies, Carlsbad, CA) en vervolgens overnacht bij 4 ° C geïncubeerd. Met anti-SPECC1L of IgG-eiwit werden G-eiwitkorrels gebruikt om SPECC1L te extraheren en Western-blotting werd uitgevoerd met behulp van de anti-SPECC1L- of IgG-proteïne-korrels. -β-catenine-antilichaam zoals hierboven beschreven. De getoonde co-IP-experimenten zijn representatief voor vier onafhankelijke experimenten.
Vaste gekweekte cellen of embryonale weefsels van muizen werden geleverd aan het elektronenmicroscopiecentrum van het University of Kansas Medical Center.In het kort werden de monsters ingebed in EMbed 812-hars (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), gedurende de nacht gepolymeriseerd bij 60°C en in secties gesneden bij 80 nm met behulp van een Leica UC7-ultramicrotoom uitgerust met een diamantzaagblad.Secties werden zichtbaar gemaakt met behulp van een JEOL JEM-1400 transmissie-elektronenmicroscoop uitgerust met een 100 kV Lab6-kanon.
Hoe dit artikel citeren: Wilson, NR et al.Een tekort aan SPECC1L leidt tot verhoogde stabiliteit van gesplitste gewrichten en verminderde delaminatie van craniale neurale lijstcellen.de wetenschap.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Inductie en differentiatie van de neurale lijst.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Craniale neurale lijstcellen in beweging: hun rol in de craniofaciale ontwikkeling.Amerikaans tijdschrift voor medische genetica.Deel A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: de groei en ontwikkeling ervan gedurende 20 jaar.Kinderarts.pathologie.laboratorium.geneesmiddel.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU en Noten MM Doorbraak in de genetica van orofaciale kloven.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. en Riley, FM Moleculaire mechanismen van craniale neurale celmigratie en patroonvorming tijdens craniofaciale ontwikkeling.Ontwikkeling 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH en Murray, JK Gespleten lip en gehemelte: inzicht in genetische en omgevingsinvloeden.natuurlijke opmerking.Genetica 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Abnormale morfogenese van de huid, ledematen en craniofaciale regio bij interferon-regulerende factor-6 (Irf6)-deficiënte muizen.Nationale Genet.38, 1335–1340, doi: 10.1038 / ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Dominante mutaties in GRHL3 veroorzaken het van der Waord-syndroom en belemmeren de ontwikkeling van het orale periderm.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ en Juriloff, DM Update de lijst met muismutanten met defecten in de sluiting van de neurale buis en vooruitgang in de richting van een volledig genetisch begrip van de sluiting van de neurale buis.Onderzoek naar geboorteafwijkingen.Deel A, Klinische en moleculaire teratologie 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-gemedieerde PDGFRalpha-signalering reguleert de overleving en proliferatie in de ontwikkeling van het skelet via een p53-afhankelijke intracellulaire route.Genontwikkeling 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND en Murdoch, JN Disheveled: relatie van convergente expansie tot neurale buissluiting.Trends in de neurologie.26, 453-455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).